KJ 201801 辣椒制品中苏丹红I的快速检测胶体金免疫层析法.doc

附件 辣椒制品中苏丹红I的快速检测 胶体金免疫层析法（KJ201801） 1　 范围 本方法规定了辣椒制品中苏丹红I的胶体金免疫层析快速检测方法。 本方法适用于辣椒酱、辣椒油、辣椒粉等辣椒制品中苏丹红I的快速测定。 2　 原理 本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的苏丹红I与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中苏丹红I进行定性判定。 3　 试剂和材料 除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。 3.1　 试剂 3.1.1　 乙腈。 3.1.2　 无水硫酸镁。 3.1.3　 正己烷。 3.1.4　 二氯甲烷。 3.1.5　 氢氧化钠。 3.1.6　 氢氧化钠溶液（2mol/L）：称取氢氧化钠（3.1.5）8g，用水溶解并稀释至100mL。 3.1.7　 无水乙醇。 3.1.8　 复溶液：将无水乙醇（3.1.7）与水按照体积比25:75混匀。 3.2　 参考物质 3.2.1　 苏丹红I参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1，纯度≥95%。 表1 苏丹红I参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量 中文名称 英文名称 CAS登录号 分子式 相对分子量 苏丹红I Sudan I 842-07-9 C16H12N2O 248.28 注：或等同可溯源物质。 3.3　 标准溶液的配制 3.3.1　 苏丹红I标准储备液（1mg/mL）：精密称取苏丹红I标准品（3.2.1）适量，置于10mL容量瓶中，加入适量乙腈（3.1.1）超声溶解后，用乙腈稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1mg/mL的苏丹红Ⅰ标准储备液。-20 ℃避光保存，有效期6个月。 3.3.2　 苏丹红I标准中间液（1μg/mL）：精密量取苏丹红I标准储备液（1mg/mL）（3.3.1）100μL，置于100mL容量瓶中，用乙腈（3.1.1）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1μg/mL的苏丹红I标准中间液。 3.4　 材料 3.4.1　 固相萃取柱：CNW Poly-sery MIP-SDR固相萃取柱（200mg/3mL），或相当者。 3.4.2　 苏丹红I胶体金免疫层析试剂盒，适用基质为辣椒酱、辣椒油、辣椒粉。 3.4.2.1　 金标微孔。 3.4.2.2　 试纸条或检测卡。 4　 仪器和设备 4.1　 移液器：200μL、1mL和5mL。 4.2　 涡旋混合器。 4.3　 离心机：转速≥4000r/min。 4.4　 电子天平：感量为0.01g。 4.5　 氮吹仪。 4.6　 水浴锅。 4.7　 环境条件：温度15℃～35℃，湿度≤80%。 5　 分析步骤 5.1　 试样制备 取适量样品，液体样品或半固体样品充分混匀，固体样品充分粉碎混匀。 5.2　 试样的提取 5.2.1 辣椒酱 称取辣椒酱2g（精确至0.01g）于15mL离心管中，加入0.5g无水硫酸镁（3.1.2）和5mL正己烷（3.1.3）提取液，涡旋振荡1min后，4000r/min离心5min。将上清液全部加入到固相萃取柱（3.4.1）中，流出液弃去。再加入6mL正己烷淋洗固相萃取柱，流出液弃去。用2mL二氯甲烷（3.1.4）洗脱固相萃取柱，收集洗脱液吹干。精密加入400μL复溶液（3.1.8），涡旋混合1min，作为待测液，立即测定。 5.2.2 辣椒油 称取辣椒油5g（精确至0.01g）于15mL离心管中，加入8mL正己烷（3.1.3）进行提取，涡旋振荡1min后，将上清液全部加入到固相萃取柱中，流出液弃去。再加入6mL正己烷淋洗固相萃取柱，流出液弃去。用2mL二氯甲烷（3.1.4）洗脱固相萃取柱，收集洗脱液吹干。精密加入400μL复溶液（3.1.8），涡旋混合1min，作为待测液，立即测定。 5.2.3 辣椒粉 称取辣椒粉3g（精确至0.01g）于50mL离心管中，加入8mL乙腈（3.1.1）提取，涡旋振荡1min后，6000r/min离心5min。转移上清液于10mL离心管中，吹干后加入2mL氢氧化钠溶液（3.1.6），涡旋混匀30s后置于80℃水浴皂化5min。再加入2mL正己烷（3.1.3），涡旋萃取30s后，6000r/min离心5min，转移上清液于新的10mL离心管中，加入无水硫酸镁（3.1.2）0.5g，涡旋振荡30s后，4000r/min离心5min，转移上清液于10mL离心管中吹干。精密加入400μL复溶液（3.1.8），涡旋混合1min，作为待测液，立即测定。 5.3　 测定步骤 5.3.1 试纸条与金标微孔测定步骤 吸取200μL待测液于金标微孔（3.4.2.1）中，抽吸5～10次使混合均匀，室温温育3～5min，将试纸条（3.4.2.2）吸水海绵端垂直向下插入金标微孔中，温育5～8min，从微孔中取出试纸条，进行结果判定。 5.3.2 检测卡与金标微孔测定步骤 吸取200μL待测液于金标微孔（3.4.2.1）中，抽吸5～10次使混合均匀，室温温育3～5min，将金标微孔中全部溶液滴加到检测卡（3.4.2.2）上的加样孔中，温育5～8min，进行结果判定。 5.4　 质控试验 每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。 5.4.1　 空白试验 称取空白试样，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。 5.4.2　 加标质控试验 准确称取空白试样（精确至0.01g）置于具塞离心管中，加入一定体积的苏丹红I标准中间液（3.3.2），使苏丹红I添加浓度为10μg/kg，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。 6　 结果判定 通过对比控制线（C线）和检测线（T线）的颜色深浅进行结果判定。目视判定示意图见图1。 6.1　 无效 控制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。 6.2　 阴性 检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色深或者检测线（T线）颜色与控制线（C线）颜色相当，表明样品中苏丹红I低于方法检测限，判定为阴性。 6.3　 阳性 检测线（T线）不显色或检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色浅，表明样品中苏丹红I的含量高于方法检测限，判定为阳性。 6.4　 质控试验要求 空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。 a) 试纸条 b) 检测卡 图1 目视判定示意图 7　 结论 当检测结果为阳性时，应对结果进行确证。 8　 性能指标 8.1　 检测限：辣椒酱、辣椒油、辣椒粉的检测限为10μg/kg。 8.2　 灵敏度：灵敏度应≥99% 8.3　 特异性：特异性应≥85%。 8.4　 假阴性率：假阴性率应≤1%。 8.5　 假阳性率：假阳性率应≤15%。 注：性能指标计算方法见附录A。 9　 其他 本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。 本方法参比标准为标准为GB/T 19681-2005《食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法》。 附录A 定性方法性能计算表 表A.1 性能指标计算方法 样品情况a 检测结果b 总数 阳性 阴性 阳性 N11 N12 N1.=N11+N12 阴性 N21 N22 N2.=N21+N22 总数 N.1=N11+N12 N.2=N21+N22 N=N1.+N2.或N.1+N.2 显著性差异(х2) c2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21), 自由度（df）=1 灵敏度（p+，%） p+=N11/N1. 特异性（p-，%） p-=N22/N2. 假阴性率（pf-，%） pf-=N12/N1.=100-灵敏度 假阳性率（pf+，%） pf+=N21/N2.=100-特异性 相对准确度，%c （N11+N22）/(N1.+N2.) 注： a由参比方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果； b由待确认方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。 N：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。 C为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。 本方法负责起草单位：南京工业大学。 验证单位：山东省食品药品检验研究院、中国农业科学院油料作物研究所。 主要起草人：熊晓辉，汪开银，卢一辰，王骏，王督。 —6—