KJ 201909 食品中硼酸的快速检测 姜黄素比色法.doc

附件9 食品中硼酸的快速检测 姜黄素比色法 （KJ201909） 1　 范围 本方法规定了食品中硼酸的姜黄素比色快速检测方法。 本方法适用于粮食制品、淀粉及淀粉制品、糕点、豆制品、速冻食品（速冻面米食品、肉丸、蔬菜丸）中硼酸的快速测定。 2　 原理 本方法采用姜黄素比色法的原理，通过超声辅助用水提取样品中硼酸，用乙基己二醇-三氯甲烷溶液对样品中的硼酸进行快速的富集、萃取，利用硫酸与姜黄素混合生成的质子化姜黄与硼酸反应生成红色产物。溶液颜色的深浅与样品中硼酸的含量成正相关，通过色阶卡进行目视比色，确定样品中硼酸的含量。 3　 试剂与材料 除另有规定外，本方法所用的试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。 3.1　 试剂 3.1.1　 硫酸。 3.1.2　 无水乙醇。 3.1.3　 亚铁氰化钾。 3.1.4　 乙酸锌。 3.1.5　 姜黄素（CAS:458-37-7），纯度≥ 99%。 3.1.6　 冰乙酸。 3.1.7　 2-乙基-1,3-己二醇（色谱纯）。 3.1.8　 三氯甲烷（色谱纯）。 3.1.9　 硫酸溶液（1+1）：取等体积的硫酸（3.1.1）与水，将硫酸缓慢加入到水中，并用玻璃棒不断的搅拌，待冷却后装入塑料容器中。 3.1.10　 亚铁氰化钾溶液：称取10.6 g亚铁氰化钾（3.1.3），用水溶解并稀释至100 mL。 3.1.11　 乙酸锌溶液：称取22.0 g乙酸锌（3.1.4），用水溶解并稀释至100 mL。 3.1.12　 2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液(EHD-CHCl3溶液)：称取2-乙基-1,3-己二醇(3.1.7) 10.6g，用三氯甲烷(3.1.8)溶解并稀释至100 mL，此溶液保存于塑料容器中。 3.1.13　 姜黄-冰乙酸溶液：称取姜黄素(3.1.5)40 mg，溶于100 mL冰乙酸(3.1.6)中，此溶液保存于塑料容器中，该溶液需临用新制。 3.2　 参考物质 硼酸参考物质中文名称、英文名称、CAS号、分子式、相对分子质量见表1。 表1 硼酸参考物质中文名称、英文名称、CAS号、分子式、相对分子质量 中午名称 英文名称 CAS登录号 分子式 相对分子质量 硼酸 Boric Acid 10043-35-3 H3BO3 61.8 3.3　 标准溶液配制 3.3.1　 硼酸标准储备液（1000 μg/mL）：准确称取在硫酸干燥器中干燥5 h以上的硼酸标准品适量，用水溶解并配制成1000 μg/mL的标准储备液，保存于塑料容器中。 3.3.2　 硼酸标准溶液（100 μg/mL）：取硼酸标准储备液10.0 mL，加水定容至100 mL，保存于塑料容器中。所配制溶液于0℃～4℃冰箱中可储存3个月。 3.4　 材料 硼酸快速检测试剂盒，需在阴凉、干燥、避光条件下保存。 4　 仪器与设备 4.1　 电子天平：感量为0.01 g。 4.2　 样品捣碎机。 4.3　 超声仪。 4.4　 离心机：转速≥4000 r/min。 4.5　 氮气吹干仪或空气吹干仪：温度控制≥60℃。 4.6　 涡旋振荡器。 4.7　 移液器：200 µL、1 mL、10 mL。 5　 分析步骤 5.1　 试样的制备 取适量样品，充分粉碎混匀。 5.2　 试样的提取 准确称取混合均匀的试样2 g（精确至0.1 g），置于50 mL离心管中，准确加水7 mL，加入硫酸溶液（3.1.9）2 mL，涡旋振荡提取1min后超声提取15 min，期间振摇2～3次，加入0.5mL亚铁氰化钾溶液（3.1.10）与0.5 mL乙酸锌溶液（3.1.11），混匀后于4000 r/min离心5 min(若离心效果不佳，可适当提高离心转速)，准确吸取1.0 mL上清液于2.0 mL离心管中，向离心管中加入EHD-CHCl3溶液（3.1.12）0.5 mL，上下颠倒振摇15～20次，静置分层（若有乳化现象，可低速离心），将上层溶液去除干净，取下层液体100 μL于2.0 mL离心管中，加入400 μL姜黄素-冰乙酸溶液（3.1.13），再加入20 μL硫酸溶液（3.1.9），于60℃～70℃水浴中氮气（或空气）吹至近干，加入1 mL无水乙醇，振摇使残渣全部溶解，为待测液。 注：粉丝、粉条等干基样品加入水和硫酸溶液后需浸泡15 min，再进行后续处理。 5.3　 测定步骤 将待测液与标准色阶卡目视比色，15 min内判读结果。需进行平行试验，两次测定结果应一致，即显色结果无肉眼可辨识差异。 注：整个试验避免在阳光直射的地方操作。 5.4　 质控试验 每批样品应同时进行空白试验和质控样品试验（或加标质控试验）。用色阶卡和质控试验同时对检测结果进行控制。 5.4.1　 空白试验 称取空白样品，按照5.1～5.3步骤与样品同法操作。 5.4.2　 质控样品试验（或加标质控试验） 5.4.2.1　 质控样品 硼酸质控样品：采用典型样品基质或相似样品基质模拟实际生产工艺生产的，含有一定量硼酸(可考虑基质本底最大可能硼酸量)，并可稳定保存的样品。样品需经参比方法确认质控样品中硼酸的含量。 5.4.2.2　 加标质控样品 硼酸加标质控样品：准确称取空白试样2 g（精确至0.1 g），加入适量硼酸标准溶液（1000 µg/mL 或100 µg/mL）（3.3），使在不同基质样品中硼酸含量与5.4.2.1相同。 质控样品（或加标质控样品）按5.1和5.2步骤与样品同法操作。 6　 结果判定要求 观察待测液的颜色，与标准色阶卡比较判读样品中硼酸的含量。颜色浅于检测限（2.5 mg/kg）则为阴性样品；颜色深于检测限的根据颜色的深浅进行判读。色阶卡见图1。 图1 硼酸色阶卡 质控试验要求：空白试验测定结果应为阴性，质控样品试验测定结果应在其标示量值允差范围内，加标质控试验测定结果应与加标量相符。 7　 结论 由于色阶卡目视判读存在一定误差，为尽量避免出现假阴性结果，读数时遵循就高不就低的原则。 8　 性能指标 8.1　 检测限 2.5mg/kg。 8.2　 灵敏度 灵敏度应≥99%。 8.3　 特异性 特异性应≥85%。 8.4　 假阴性率 假阴性率应≤1%。 8.5　 假阳性率 假阳性率应≤15%。 注：性能指标计算方法见附录A。 9　 其他 本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不作限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。色阶卡应确保在试剂盒保质期内不出现褪色或变色的情况。 若检测结果大于检测限，需对其进行研判，并采用参比方法确证。 本方法的参比方法为GB 5009.275-2016《食品安全国家标准 食品中硼酸的测定》。 附录A 快速检测方法性能指标计算表 表A.1 性能指标计算方法 样品情况a 检测结果b 总数 阳性 阴性 阳性 N11 N12 N1.=N11+N12 阴性 N21 N22 N2.=N21+N22 总数 N.1=N11+N12 N.2=N21+N22 N=N1.+N2.或N.1+N.2 显著性差异(х2) c2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21), 自由度（df）=1 灵敏度（p+，%） p+=N11/N1. 特异性（p-，%） p-=N22/N2. 假阴性率（pf-，%） pf-=N12/N1.=100-灵敏度 假阳性率（pf+，%） pf+=N21/N2.=100-特异性 相对准确度，%c （N11+N22）/(N1.+N2.) 注： a由参比方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果； b由待确认方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。用于确认方法时，结果≥2.5mg/kg时，判定为阳性（仅用于计算性能指标）； c本方法规定：用于计算灵敏度和假阴性率的阳性样品，由参比方法检验得到的结果范围应在2.5～10mg/kg之间。 N：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。 d为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。 本方法负责起草单位：陕西省食品药品监督检验研究院 验证单位：江南大学、四川省食品药品检验检测院、湖北省食品质量安全监督检验研究院 本方法的主要起草人为：李涛 林芳 袁磊 乔蓉霞 孙秀兰 王一欣 周陶鸿