DB37T 4204-2020 水貂阿留申病诊断与净化技术.doc

ICS 65.020.30 B 41       DB37 山东省地方标准 DB37/T 4204—2020       水貂阿留申病诊断与净化技术 Aleutian disease diagnose and cleaning-up technology for mink farm 2020 - 11 - 10发布 2020 - 12 - 10实施 山东省市场监督管理局   发布 DB37/T 4204—2020 前  言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省动物疫病预防与控制中心、中华人民共和国北京海关检科院、齐鲁动物保健品有限公司、青岛农业大学、河北科技师范学院、威海市畜牧业发展中心、山东省农业科学院家禽研究所、山东省动物卫生技术中心。 本标准主要起草人：王贵升、张鹤晓、马泽芳、史秋梅、张洪学、赵国清、黄兵、徐启杰、王蕾、李玉杰、刘长浩、徐鸿、李金波、马慧玲、蔺晓月、崔凯、陈静、李富金、王士荣。 8 水貂阿留申病诊断与净化技术 1　 范围 本标准规定了水貂阿留申病临床诊断技术、病毒抗体检测技术、荧光PCR检测、病兽淘汰技术、兽群饲养环境控制技术和无害化处理的技术要求。 本标准适用于水貂阿留申病感染动物的筛选、感染控制与净化。 2　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682　分析实验室用水规格和实验方法 GB 7959　粪便无害化卫生标准 GB 8978　污水综合排放标准 SN/T 2847　水貂阿留申病检疫技术规范 DB37/T 2381　规模化水貂养殖场生物安全体系 DB37/T 2660　规模化毛皮动物养殖场消毒技术 3　 临床诊断 3.1　 流行病学 3.1.1　 各个年龄、性别和品种的水貂对本病毒都有易感性。潜伏期为60天～90天，有的长达7个月～9个月，个别可达1年以上，病程1周左右，最快2天～3天可死亡。感染率高，高达80 %，死亡率低。 3.1.2　 传染源主要为病貂和隐性感染貂。病毒的群间传播主要是来自感染貂的唾液、粪便和尿，及其污染的环境、饲料、饮水和用具。经消化道、呼吸道及交配传染，也可通过母貂胎盘直接传递给子代。蚊虫叮咬、注射器针头等传播途径亦应引起重视。 3.1.3　 有明显的季节性，秋冬季节的发病率与病死率明显地比其他季节高。 3.1.4　 本病为终生毒血症。 3.1.5　 雪貂、狐狸、貉也可感染发病。 3.2　 临床症状 3.2.1　 渐进性消瘦：病貂食欲时好时坏，貂体逐渐消瘦，严重病貂体重急剧下降。 3.2.2　 出血和贫血：口腔、齿龈、软腭、硬腭和舌根有大量出血点和出血斑，内脏器官尤其是消化道出血，排出煤焦油样粪便。贫血症状口腔黏膜、眼结膜和阴道黏膜及脚趾苍白 3.2.3　 渴欲增强。 3.2.4　 如侵害神经系统，表现抽搐、痉挛、共济失调、后躯麻痹等症状，2天～3天死亡。 3.2.5　 本病预后不良，对症治疗可缓解症状。常复发，最后衰竭死亡。 3.3　 病理变化 3.3.1　 尸体营养不良，消瘦、贫血，内脏出血。 3.3.2　 肾肿大2倍～3倍，橘黄色，黄白色斑点。表面凸凹不平，有斑点状出血，间有灰白色坏死灶，呈麻雀卵样；慢性病例肾略肿，呈灰黄色，包膜难于剥离，隆起部为土黄色颗粒、无光；凹陷部分为乳白色、圆形小点，皮质切面为乳白色小点。 3.3.3　 肝、脾、淋巴结肿胀，肝呈土黄色，或见有灰白色斑点、质脆；胸腺体积缩小。 3.3.4　 怀孕期发病可见死胎、胎儿液化、吸收或者出现木乃伊胎儿、子宫出血。 3.3.5　 瘫痪病例可见脑膜出血。 4　 抗体检测 4.1　 样品的采集与保存 4.1.1　 准备工作：将准备采血的水貂全部单笼放置，一一对应清晰编号。1.5 mL离心管或者1 mL～2 mL注射器、离心管架、剪刀或指甲剪、酒精棉、干脱脂棉、记号笔，有条件的使用采血板和毛细管。 4.1.2　 采血方法：将水貂保定，剪刀酒精棉消毒，中趾趾间毛细管采血或直接剪掉中趾趾尖挤出0.3 mL～0.5 mL血，滴入离心管或注射器，脱脂棉压迫止血，注明编号。 4.1.3　 样品保存及运输：2 ℃～8 ℃，不超过24 h。 4.2　 样品处理 将装有血液的离心管静置，待血清析出，经4 000 r/min离心3 min～5 min，取血清置于1.5 mL离心管中。 4.3　 对流免疫检测 按照SN/T 2847的要求进行检测。 5　 荧光PCR检测 5.1　 仪器设备 5.1.1　 荧光PCR检测仪及配套反应管（板）。 5.1.2　 小型台式低温高速离心机（离心速度13 000 r/min以上）。 5.1.3　 混匀器。 5.1.4　 冰箱（2 ℃～8 ℃和-20 ℃两种）。 5.1.5　 微量移液器（0.5 μL～10 μL；2 μL～20 μL；20 μL～200 μL；100 μL～1 000 μL）及配套吸头。 5.1.6　 1.5 mL离心管（无核酸酶）。 5.1.7　 DNA核酸提取试剂 5.2　 试剂或材料 5.2.1　 阴性质控。 5.2.2　 阳性质控。 5.2.3　 蛋白酶K。 5.2.4　 SDS。 5.2.5　 或商品化实时荧光定量PCR试剂盒。 5.3　 样品的采集与保存 5.3.1　 拭子样品 有咽喉拭子样品和肛拭子样品： a) 咽喉拭子采样，采样时要将拭子深入喉头及上腭来回刮3次～5次，取咽喉分泌液。然后将拭子插入到装有1.0 mL PBS无菌离心管管中，编号备用； b) 肛拭子采样，采样时要将拭子深入肛门来回刮3次～5次，取排泄物。然后将拭子插入到装有1.0 mL PBS无菌管中，编号备用。 5.3.2　 内脏或肌肉样品 用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品1.0 g于研钵中充分研磨，再加5.0 mL PBS混匀，然后将组织悬液转入无菌管中，编号备用。 5.3.3　 血清或血浆 用无菌注射器直接吸取至无菌管中，编号备用。 5.3.4　 存放 采集或处理的样本在2 ℃～8 ℃条件下保存，不超过24 h。 5.4　 实验步骤 5.4.1　 样本病毒核酸DNA提取 普通提取方法，或者采用经验证的病毒DNA提取试剂盒，按照试剂盒使用说明书提取。 5.4.2　 扩增试剂准备 5.4.2.1　 引物，根据衣壳蛋白VP2基因设计引物探针，扩增片段大小为168 bp。引物序列参见附录A。根据需要配制荧光PCR反应液或购买商品化试剂盒。 5.4.2.2　 荧光PCR反应液，在室温下融化后，2 000 r/min离心5 sec。 5.4.2.3　 准备n个洁净、经无核酸酶处理的PCR反应管，设所需PCR管数为n（n =样本数+1管阴性对照+1管阳性对照）。 5.4.2.4　 每个测试反应体系需要15 μL PCR反应液和0.5 μL Taq酶。计算好各试剂的使用量，加入一适当体积离心管中，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装15 μL，转移至样本处理区。 5.4.3　 加样 在样品处理区进行。分别向上述PCR管中加入样本核酸提取步骤5.4.1中制备的DNA溶液10 μL，盖紧管盖，500 r/min离心30 sec。 5.4.4　 荧光PCR反应 在检测区进行。将加样后的PCR管放入荧光PCR检测仪内，记录PCR管摆放顺序。反应参数设置：第一阶段，94 ℃/3 min；第二阶段，94 ℃/15 sec，60 ℃/60 sec共40个循环，最后40 ℃/2 min。荧光收集在第二阶段每次循环的60 ℃延伸时进行。 5.5　 结果判定 5.5.1　 结果分析条件的设定 阈值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点为准。选定FAM检测通道读取检测结果；ABI仪器，选择FAM作为报告荧光基团，无淬灭荧光基团。 5.5.2　 质控标准 5.5.2.1　 阴性对照无Ct/Cp值并且无扩增曲线。 5.5.2.2　 阳性对照的Ct/Cp值应小于等于28，并出现典型的扩增曲线。 5.5.2.3　 如阴性和阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。 5.5.3　 结果判定 阴性：无Ct/Cp值，且无特征性扩增曲线，表明样品为阴性。 阳性：Ct/Cp值≤30.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品为阳性。 复验：Ct/Cp值大于30.0，且出现典型的扩增曲线的样品建议复验。复验仍出现上述结果的，判为阳性，否则判为阴性。 5.6　 实验室规范 荧光PCR检测方法的实验室规范详见附录B。 6　 病兽淘汰 6.1　 检测方法的选择：抗体检测技术适用于群体检测，PCR检测技术适应小规模检测和抗体阳性样品的进一步确诊。不同实验室可以根据样品量、样品种类以及检测目的选择使用。 6.2　 分群：定期开展检测工作，检测出阳性样品后，结合临床症状，初步确定阳性水貂和阴性水貂，立即分群，并对阳性貂进行隔离。 6.3　 一次性净化：把检测出的阳性水貂直接淘汰，或作为皮兽饲养，不再留作种用。 6.4　 逐步净化：实行阿留申病毒阴阳性貂分场（群）饲养，逐步淘汰阳性貂。分（场）群后，应建立隔离饲养管理制度，避免水平传播。种貂，配种时阳性貂群独立统一配种，阴性貂群独立统一配种，切勿混合。 7　 兽群环境控制 7.1　 阿留申病阴性群：做好生物安全控制，日常管理遵照DB37/T 2381的规定执行。 7.2　 阿留申病阳性群：在做好生物安全控制的同时做好环境消毒控制，遵照DB37/T 2660的规定执行。 8　 无害化处理 8.1　 废弃物处理 对污染的饲料、垫料等废弃物以及粪便、污水应按照GB 7959和GB 8978进行无害化处理。 8.2　 病死水貂处理 病死水貂按照农业农村部《病死及病害动物无害化处理技术规范》的规定进行无害化处理。 8.3　 记录与档案 应按照《畜禽标识和养殖档案管理办法》建立并保存养殖档案。主要包括水貂的品种、来源、数量、标识情况和进出场日期；检测、免疫、消毒情况；畜禽发病、死亡、淘汰和无害化处理情况等。养殖档案的保存时间不得少于2年。 A A 附　录　A （资料性附录） 引物和探针 F CAACCCTCCAGGTCAACTCT R CTCTTAACAGGATTCCAGCATGT P FAM-AAGCTTGCCTCTCCAAGTAAAGTAACCA-BHQ1 B B 附　录　B （资料性附录） 水貂阿留申病毒荧光PCR检测方法的实验室规范 B.1　 实验室设置要求 实验室设置要求如下： —— 实验室分为三个相对独立的区域：样本制备区、反应混合物配置区和检测区； —— 工作区域须有明确标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用； —— 每一区域须有专用的仪器设备 —— 整个实验过程中均须使用无RNA酶的一次性耗材，用到的玻璃器皿使用前须250 ℃干烤4 h以上，以彻底去除RNA酶； —— 各区域的一起设备须有明确标记，以避免设备物品从各自的区域移出，造成不同的工作区域间设备物品发生混淆； —— 进入各个工作区域严格遵循单一方向顺序，即只能从样本制备区、扩增反应混合物配置区至检测区； —— 在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服，以便于鉴别；离开工作区时，不得将各区特定的工作服带出； —— 实验室清洁时应该样本制备区、扩增反应混合物配置区至检测区的顺序进行； —— 不同的实验区域应