DB37T 3880-2020 鸭疫里默氏杆菌病诊断技术规程.doc

ICS11.220 B 41       DB37 山东省地方标准 DB37/T 3880—2020       鸭疫里默氏杆菌病诊断技术规程 Diagnostic techniques for Riemerella Anatipestifer infection 2020-03-16发布 2020-04-16实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 3880—2020 前  言 本标准按照GB/T 1.1－2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院家禽研究所、山东省动物疫病预防与控制中心、威海市畜牧业发展中心、临沂市畜牧发展促进中心。 本标准主要起草人：黄兵、李玉峰、马秀丽、于可响、宋敏训、赵国清、秦卓明、刘存霞、林树乾、陈静、谭善杰、郭效珍、赵巧雅。 11 鸭疫里默氏杆菌病诊断技术规程 1　 范围 本标准规定了鸭疫里默氏杆菌病的临床诊断、细菌分离、病原核酸检测和综合判定的技术要求。 本标准适用于鸭疫里默氏杆菌病的诊断与检测。 2　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4789.28　食品安全国家标准　食品微生物学检验　培养基和试剂的质量要求 GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489　实验室　生物安全通用要求 NY/T 541　兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3　 临床诊断 3.1　 流行病学 该病一年四季均可发生，鸭、鹅、野生水禽和火鸡均可发病，1周龄~8周龄鸭高度敏感，5周龄以下死亡较快，较大的鸭可能存活时间较长，该病在种鸭中少见。 3.2　 临床症状 3.2.1　 最急性型 很少出现明显症状即突然死亡。 3.2.2　 急性型 常见于2周龄～3周龄的雏鸭，病程1日～3日。患鸭精神沉郁、嗜睡、厌食、离群、不愿走动或行动迟缓，眼鼻分泌物增多，患鸭呼吸困难、缩颈或以喙抵地，濒死期出现神经症状呈角弓反张、抽搐等。 3.2.3　 慢性型 常见于4周龄～7周龄鸭，病程可达一周以上。主要表现为精神沉郁、厌食、腿软弱无力、不愿走动、伏卧或呈犬坐姿势，共济失调、痉挛性点头或头左右摇摆，难以维持躯体平衡，部分病例头颈歪斜，当遇到惊扰时呈转圈运动或倒退，部分患鸭跛行。感染后存活的鸭往往生长迟缓。 3.3　 病理变化 特征性病变为病死鸭浆膜出现广泛性的纤维素性渗出，包括心包炎、气囊炎和肝周炎。慢性病例可见脑炎。 3.4　 判定标准 若发病鸭符合3.1流行病学特征、3.2临床症状和3.3病理变化，可判为鸭疫里默氏杆菌病疑似病例，应进行细菌分离和核酸检测确诊。 4　 实验室诊断 除非另有规定，实验室诊断所用化学试剂均为分析纯；试验用水符合GB/T 6682二级水的规定；实验室生物安全要求按照GB 19489执行。 4.1　 细菌分离 4.1.1　 仪器和设备 4.1.1.1　 生物安全柜。 4.1.1.2　 CO2培养箱。 4.1.1.3　 显微镜。 4.1.2　 试剂或材料 4.1.2.1　 血清琼脂平板（见附录A.1）。 4.1.2.2　 麦康凯琼脂平板（见附录A.2）。 4.1.2.3　 革兰氏染色液。 4.1.2.4　 瑞氏染色液。 4.1.3　 操作步骤 4.1.3.1　 取样 按NY/T 541要求无菌采集发病鸭的肝脏或脑（有典型纤维素性渗出时采集肝脏，有神经症状时采集脑）。 4.1.3.2　 分离培养 将接种环伸入组织内部，然后划线接种于血清琼脂平板和麦康凯琼脂平板，平板的配制根据根据GB 4789.28的规定进行操作，含5%～10% CO2 的37 ℃培养箱或烛缸中培养24 h～48 h。挑取符合4.1.3.3描述的典型菌落，划线接种于血清琼脂平板进行纯化培养。 4.1.3.3　 菌落形态 在血清琼脂平板培养基上见有湿润、呈露滴样、圆形隆起、表面光滑、边缘整齐的菌落，直径为1 mm～2 mm，颜色为灰白色；而麦康凯琼脂平板上无菌落生长。挑选单个典型菌落进行革兰氏染色和瑞氏染色，并镜检。革兰氏阴性，为无鞭毛、不运动、不形成芽胞的小杆菌。单个、成双或呈短链状排列，菌体形态除杆状外，部分呈椭圆形，偶见呈长丝状。细菌大小宽为0.2 μm～0.5 μm，长为1 μm～5 μm，呈丝状的菌体可长达11 μm～24 μm。瑞氏染色可见大多数菌体呈两极着染。 4.1.4　 结果判定 分离的细菌如同时符合4.1.3.3和4.1.3.4，可判定为疑似鸭疫里默氏杆菌。 4.2　 病原核酸检测 4.2.1　 PCR方法 4.2.1.1　 仪器和设备 4.2.1.1.1　 高速冷冻离心机。 4.2.1.1.2　 PCR扩增仪。 4.2.1.1.3　 电泳仪。 4.2.1.1.4　 紫外分析仪。 4.2.1.1.5　 微量加样器：0.5 µL～10 µL；2 µL～20 µL；20 µL～200 µL；100 µL～1 000 µL。 4.2.1.2　 试剂或材料 4.2.1.2.1　 阴性质控。 4.2.1.2.2　 阳性质控（灭活细菌培养物）。 4.2.1.2.3　 蛋白酶K。 4.2.1.2.4　 PBS（附录B.1）。 4.2.1.2.5　 TE（附录B.2）。 4.2.1.2.6　 SDS（附录B.3）。 4.2.1.2.7　 琼脂糖凝胶（附录B.4）。 4.2.1.2.8　 TAE电泳液（附录B.5）。 4.2.1.3　 样品处理及核酸提取 4.2.1.3.1　 组织样品 无菌取疑似鸭疫里默氏杆菌病的肝脏、脾脏等脏器组织1.0 g～5.0 g，按10%（g/mL）加入PBS，研磨匀浆。-20 ℃保存备用。取100 μL组织匀浆液加入400 μL TE中充分混匀，再加终浓度为1%的SDS和100 μg/mL的蛋白酶K，置56 ℃水浴消化2 h，冷至室温后用酚及氯仿各抽提两次，无水乙醇沉淀，75%乙醇洗涤，最后用40 μL DEPC水溶解DNA，作为PCR模板，或保存于-20 ℃。或者用商品化的DNA提取试剂盒提取DNA。 4.2.1.3.2　 菌落样品 挑取4.1.3.2可疑菌落，加到含20 μL灭菌去离子水的PCR离心管中，压紧管盖，煮沸10 min，再冰浴10 min后离心取上清作为PCR模板样品。或者用商品化的DNA提取试剂盒提取DNA。 4.2.1.4　 引物 根据GenBank中发表的鸭疫里黙氏杆菌16s RNA基因序列设计引物，扩增片段大小为475 bp。上游引物RA-001F:5’-TTA GAT AGT TGG TGA GGT AA-3’。下游引物RA-002R:5’-ATC GGT GTT CTG AGT AAT-3’。 4.2.1.5　 PCR扩增 4.2.1.5.1　 反应体系 反应体系为25 µL，配制见表1。 表1　 PCR反应体系配制 PCR反应体系中各成分 每个样品反应组分用量/µL 10×PCR buffer 2.5 2.5 mmol/L dNTP 2.0 10 µmol/L引物F 0.5 10 µmol/L引物R 0.5 5 U/µL Taq E 0.5 模板 1.0 无RNA酶去离子水 18.0 总体积 25.0 4.2.1.5.2　 反应程序 采用以下反应程序进行扩增： —— 第一阶段：95 ℃ 5 min； —— 第二阶段：95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共进行30个循环； —— 第三阶段：72 ℃ 10 min。 PCR扩增也可使用商品化的PCR试剂盒，按说明书要求操作。 4.2.1.5.3　 电泳 反应结束后取10.0 µL PCR产物与1.0 µL 10×上样缓冲液混合，加到1%琼脂糖凝胶板的加样孔中，同时设DNA分子量标准参照，以5 V/cm电压进行电泳20 min～40 min，在凝胶成像仪上观察结果。 4.2.1.6　 结果判定 4.2.1.6.1　 试验成立的条件 在阳性质控出现一条大小475 bp的单一条带，同时阴性质控无此条带的情况下，检测结果成立。 4.2.1.6.2　 结果的判定 被检样品出现与阳性质控同样大小的条带时，判为阳性；被检样品未出现与阳性质控同样大小的条带时，判为阴性。如果阴、阳性质控结果不成立，则全部样品应该重做。参见附录C。 4.2.2　 实时荧光定量PCR方法 4.2.2.1　 仪器和设备 4.2.2.1.1　 实时荧光定量PCR检测仪。 4.2.2.1.2　 台式高速冷冻离心机。 4.2.2.1.3　 涡旋振荡器。 4.2.2.1.4　 可调移液器：0.5 µL～10 µL；2 µL～20 µL；20 µL～200 µL；100 µL～1 000 µL。 4.2.2.1.5　 无RNA酶的荧光定量PCR管。 4.2.2.2　 试剂或材料 4.2.2.2.1　 阴性质控。 4.2.2.2.2　 阳性质控（灭活细菌培养物）。 4.2.2.2.3　 蛋白酶K。 4.2.2.2.4　 SDS。 4.2.2.2.5　 实时荧光定量PCR试剂盒。 4.2.2.3　 样品处理及核酸提取 4.2.2.3.1　 组织样品 参见4.2.1.3.1。 4.2.2.3.2　 菌落样品 参见4.2.1.3.2。 4.2.2.4　 引物 根据GenBank中发表的鸭疫里黙氏杆菌16s RNA基因序列设计引物，扩增片段大小为190 bp。上游引物RA-003F:5’-GCT GGA ATG AGT AGT GTA G-3’。下游引物RA-004R:5’-GCT TAG TCT CTG AAC CAT ATA G-3’。 4.2.2.5　 荧光定量PCR 4.2.2.5.1　 反应体系 采用20 µL反应体系，组成见表2。 表2　 荧光PCR反应体系配制 反应体系中各成分 每个样品反应组分用量/µL 2×SYBR Premix 10.0 10 µmol/L引物P3 1.0 10 µmol/L引物P4 1.0 模板 2.0 无RNA酶去离子水 6.0 总体积 20.0 4.2.2.5.2　 反应程序 采用以下反应程序进行扩增： —— 第一阶段：95 ℃ 2 min； —— 第二阶段：95 ℃ 20 s，57 ℃ 1 min，共进行40个循环，57 ℃时收集荧光。 反应结束后根据分析软件得出的Ct值和扩增曲线来判定结果。 4.2.2.5.3　 结果判定 4.2.2.5.3.1　 试验成立的条件 阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。阴性质控的检测结果应无特异性扩增；阳性质控的Ct值应＜28.0，则试验成立。 4.2.2.5.3.2　 结果的判定 当被检样品Ct值≤30且出现典型扩增曲线时，判为阳性；当被检样品无Ct值或者Ct值≥35时，判为阴性；当被检样品在30＜Ct值＜35时判为可疑，需重做，再次检测结果的Ct值＜35，且出现典型扩增曲线，则可判为阳性，否则判为阴性。结果判定见附录E。 5　 综合判定 符合3.4临床诊断规定的疑似病例经4.2.1和4.2.2中的任一方法检测，结果为阳性者，可判定为鸭疫里默氏杆菌病。 A A 附　录　A （规范性附录） 试剂的配制 A.1　 PBS（0.01 mol/L，pH 7.2） 氯化钠 8.00 g 氯化钾 0.2 mL 磷酸二氢钾 0.2 mL 磷酸氢二钠 2.89 g 硫柳汞 0.1