DB37T 3856-2019 饲料中黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素B1和玉米赤霉烯酮的测定　高效液相色谱-串联质谱法.doc

ICS 65.120 B 46       DB37 山东省地方标准 DB 37/T 3856—2019       饲料中黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素B1和玉米赤霉烯酮的测定　高效液相色谱-串联质谱法 Determination of aflatoxin B1, deoxynivalenol, fumonisins B1 and zearalenone in feeds—High performance liquid chromatography - tandem mass spectrometry 2019 - 12 - 31发布 2020 - 01 - 31实施 山东省市场监督管理局   发布 DB37/T 3856—2019 前  言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会提出并归口。 本标准起草单位：青岛农业大学、德州学院、山东省农业科学院家禽研究所。 本标准主要起草人：朱连勤、陈甫、高晨、朱风华、李福伟、邱慧玲、王倩文、孙京新。 7 饲料中黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素B1和玉米赤霉烯酮的测定　高效液相色谱-串联质谱法 警示——由于黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素B1和玉米赤霉烯酮等霉菌毒素是毒性很强的有毒物质，应小心处理，分析操作过程应在通风橱内或指定区域内进行。分析过程中，操作者应采取相应的防护措施，应穿工作服、戴眼镜、口罩、医用乳胶手套，避免吸入、接触霉菌毒素溶液。分析结束后，凡接触过霉菌毒素的器皿及霉菌毒素溶液应使用浓度为5 %次氯酸钠溶液浸泡过夜后清洗。为了降低接触霉菌毒素的机会，本标准鼓励直接购买并使用霉菌毒素的有证标准储备液。 1　 范围 本标准规定了饲料中黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素B1和玉米赤霉烯酮含量测定的高效液相色谱—串联质谱测定方法。 本标准适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、添加剂预混料中黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素B1和玉米赤霉烯酮含量的测定。 本方法中黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素B1和玉米赤霉烯酮的检出限为0.005 μg/kg、10 μg/kg、10 μg/kg和0.10 μg/kg。 2　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1　饲料　采样 GB/T 20195　动物饲料　试样的制备 3　 原理 试样中的黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素B1和玉米赤霉烯酮经乙腈溶液提取，再经滤纸和有机滤膜净化，采用高效液相色谱-串联质谱法测定，外标法定量。 4　 试剂或材料 除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。 4.1　 水：符合GB/T 6682中规定的一级用水。 4.2　 乙腈：色谱纯。 4.3　 甲醇：色谱纯。 4.4　 甲酸：色谱纯。 4.5　 醋酸铵：优级纯。 4.6　 提取溶液：准确量取乙腈840 mL 和水160 mL，混匀，即得。 4.7　 甲酸溶液（0.4 %）：准确量取甲酸4 mL加水定容至1 000 mL，混匀，即得。 4.8　 醋酸铵溶液（1%）：准确称取醋酸铵1.000 0 g加水定容至100 mL，混匀，即得。 4.9　 甲酸醋酸铵溶液：取甲酸溶液（4.7）50 mL加醋酸铵溶液（4.8）50 mL，混匀，即得。 4.10　 黄曲霉毒素B1对照品：纯度≥98.0 %。 4.11　 玉米赤霉烯酮对照品：纯度≥98.0 %。 4.12　 伏马毒素B1对照品：纯度≥98.0 %。 4.13　 呕吐毒素对照品：纯度≥98.0 %。 4.14　 标准储备溶液：分别精确称取4种霉菌毒素对照品至棕色容量瓶中，用提取溶液（4.6）配成浓度为1 000 μg/mL的霉菌毒素标准储备溶液，-20 ℃保存，有效期为6个月。或有证标准溶液。 4.15　 混合标准储备溶液：分别精密量取4种霉菌毒素标准储备溶液1 mL，置于棕色容量瓶中，用提取溶液（4.6）定容至100 mL，配置成浓度为10.0 μg/mL的混合标准储备溶液，4 ℃保存。 4.16　 标准系列工作溶液：将混合标准储备溶液用乙腈稀释成0.01 ng/mL、0.10 ng/mL、1.0 ng/mL、10.0 ng/mL、100.0 ng/mL、1 000.0 ng/mL的混合标准系列工作溶液，临用新配。 4.17　 针头式过滤器：有机型，孔径0.22 μm。 5　 仪器设备 5.1　 高效液相色谱—串联质谱仪：配有电喷雾电离源。 5.2　 旋涡混合器。 5.3　 分析天平：感量为0.1 mg。 5.4　 气浴摇床。 6　 样品 按GB/T 14699.1规定采集有代表性的试样，按照GB/T 20195规定将试样粉碎，过0.42 mm分析筛，混匀装入密闭容器中，备用。 7　 试验步骤 7.1　 试样处理 平行做两份试验。称取5.000 g（精确到0.000 2 g）试样置于50 mL 具塞锥形瓶中，准确加入25.0 mL 提取溶液（4.6），室温下涡旋混匀大于2 min，置于120 r/min气浴摇床中提取1.0 h，取出用中速定量滤纸过滤，取5.0 mL滤液，经0.22 μm针头式过滤器过滤后，待测。 7.2　 标准系列 分别取1 mL标准系列工作溶液（4.16）于具塞离心管中，经0.22 μm针头式过滤器过滤后，待测。 7.3　 液相色谱—串联质谱法条件 7.3.1　 液相色谱参考条件 色谱柱：C8柱，100 mm × 2.1 mm, 粒径1.8 μm；或性能相当者。 柱温：33 ℃。 进样体积：20 μL。 流动相A：乙腈。 流动相B：甲酸醋酸铵溶液。 流速：0.2 mL/min。 流速及梯度洗脱条件见表 1。 表1　 流动相、流速及梯度洗脱参考条件 时间，min 流动相A，mL/min 流动相B，%（v/v） 0 0.2 20 2 0.2 50 6 0.2 100 8 0.2 100 8.1 0.2 20 10 0.2 20 7.3.2　 质谱参考条件 离子源：电喷雾离子源（ESI）。 扫描方式：正负离子扫描模式。 检测方式：多离子反应监测（MRM）。 脱溶剂气、锥孔气：氮气。 碰撞气：高纯氮气。 定性离子对、定量离子对、保留时间及对应的锥孔电压和碰撞能量参考值见表2。 表2　 质谱测定参考值 霉菌毒素 ESI检测模式 定性离子对 m/z 定量离子对 m/z 锥孔电压 V 碰撞能量 eV 黄曲霉毒素B1 + 313.1＞241.0 313.1＞241.0 40 32 呕吐毒素 + 297.2＞265.1 297.2＞265.1 24 27 伏马毒素B1 + 722.4＞334.1 722.4＞334.1 50 34 玉米赤霉烯酮 - 317.0＞175.1 317.0＞175.1 15 26 8　 测定 8.1　 标准工作曲线与监测图 在上述液相色谱—串联质谱法条件下，测定前确定各气体流量以使质谱灵敏度达到要求，毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量等电压值应优化至最高灵敏度。将霉菌毒素标准系列溶液、试样溶液置于液相色谱—串联质谱仪，测定相应的峰面积，采用单点或多点校正，外标法定量。4种霉菌毒素质谱图参见附录A，多离子反应监测色谱图参见附录B。 8.2　 定性测定 在相同试验条件下，试样中待测物质保留时间与标准溶液保留时间一致，所选择的定性离子对的荷质比也一致，且试样中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表3规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物。 表3　 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差（%） 相对离子丰度 ＞50 ＞20～50 ＞10～20 ≥10 允许的最大偏差 ±20 ±25 ±30 ±50 8.3　 定量测定 在上述液相色谱—串联质谱仪器最佳工作条件下，混合标准工作液与试样交替进样，采用标准溶液单点或多点校正，外标法定量。试样溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内，当试样的上机液浓度超过线性范围时，需根据测定浓度，稀释后进行重新测定。 9　 试验数据处理 试样中黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素B1或玉米赤霉烯酮的含量ω，以质量分数表示，单位为微克每千克（μg/kg），用式（1）计算： (1) 式中： ω ——试样中黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素B1或玉米赤霉烯酮的含量，单位为微克每千克（μg/kg）； Csi ——混合标准工作溶液中黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素B1或玉米赤霉烯酮的浓度，单位为微克每升（μg/L）； Ai ——试样溶液中黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素B1或玉米赤霉烯酮的峰面积； Asi ——混合标准溶液中黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素B1或玉米赤霉烯酮的峰面积； V ——试样中定容体积，单位为毫升（mL）； M ——试样的质量，单位为克（g）； Ci ——试样溶液中黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素B1或玉米赤霉烯酮的浓度，单位为微克每升（μg/L）； n ——稀释倍数。 以两个平行样品测定结果的算术平均值报告结果，结果保留三位有效数字。 10　 精密度 在重复条件下，两次独立测定结果与其算数平均值的绝对差值，不大于该平均值的15 %。 11　 回收率与变异系数 本标准中黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素B1和玉米赤霉烯酮的加样回收率分别为95.93 %～101.56 %、95.12 %～106.04 %、96.12 %～105.84 %和96.86 %～101.51 %，RSD值分别为0.18 %～1.58 %、1.05 %～3.20 %、0.15 %～2.14 %和0.88 %～2.07 %。 A A 附　录　A （资料性附录） 黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素B1和玉米赤霉烯酮标准溶液质谱扫描图 黄曲霉毒素B1标准溶液质谱图见图A.1。 图A.1　 黄曲霉毒素B1标准溶液（1.0 μg/kg）质谱图 呕吐毒素标准溶液质谱图见图A.2。 图A.2　 呕吐毒素标准溶液（1 000 μg/kg）质谱图 伏马毒素B1标准溶液质谱图见图A.3。 图A.3　 伏马毒素B1标准溶液（1 000 μg/kg）质谱图 玉米赤霉烯酮标准溶液质谱图见图A.4。 图A.4　 玉米赤霉烯酮标准溶液（100 μg/kg）质谱图 B B 附　录　B （资料性附录） 黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素B1和玉米赤霉烯酮多离子反应检测（MRM）色谱图 黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素B1和玉米赤霉烯酮多离子反应检测（MRM）色谱图见图B.1。 a 黄曲霉毒素B1在3.8 min～4 min出峰，呕吐毒素在4.7 min～4.9 min出峰，伏马毒素B1在2.8 min～3 min出峰，玉米赤霉烯酮在5.1 min～5.3 min出峰 图B.1　 黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素B1和玉米赤霉烯酮多离子反应检测（MRM）色谱图 _________________________________