DB37T 3821-2019 鸭新型呼肠孤病毒病诊断技术规范.doc

ICS 11.220 B 41       DB37 山东省地方标准 DB 37/T 3821—2019       鸭新型呼肠孤病毒病诊断技术规范 Diagnostic techniques for novel duck reovirus disease 2019 - 12 - 24发布 2020 - 01 - 24实施 山东省市场监督管理局   发布 DB37/T 3821—2019 前  言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院家禽研究所。 本标准主要起草人：于可响、宋敏训、李玉峰、马秀丽、刘存霞、姜亦飞、胡峰、亓丽红、黄兵、郭效珍、刘玉山。 10 鸭新型呼肠孤病毒病诊断技术规范 1　 范围 本标准规定了鸭新型呼肠孤病毒病的临床诊断、实验室诊断和综合判定技术规范。 本标准适用于鸭新型呼肠孤病毒病的诊断和流行病学调查。 2　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489　实验室生物安全通用要求 NY/T 541　兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3　 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1　 鸭新型呼肠孤病毒病 又称“肉鸭脾坏死症”、“番鸭出血性坏死性肝炎”，是由鸭新型呼肠孤病毒引起的多品种雏鸭脾脏出血和坏死为主要特征的疾病。该病毒在血清学和基因序列上与原有的番鸭呼肠孤病毒有明显差异。 4　 临床诊断 4.1　 流行病学 该病一年四季均可发生，不同品种的鸭均可发病，如樱桃谷鸭、麻鸭、番鸭、半番鸭等；发病日龄一般为5～25日龄，其中以5～10日龄居多，病程5～7天。 4.2　 临床症状 病鸭精神沉郁，发育不良，部分拉白色稀粪，一般不会出现神经症状，容易继发鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌等细菌感染。发病率5 %～35 %，死亡率20 %以下。 4.3　 病理变化 脾脏表面出血或坏死是其主要病变特征。 4.4　 结果判定 符合4.1流行病学特征，病鸭出现4.2临床症状和4.3病理变化，可判为鸭新型呼肠孤病毒病疑似病例，应进行实验室确诊。 5　 实验室诊断 除非另有规定，实验室诊断所用化学试剂均为分析纯；试验用水符合GB/T 6682二级水的规定；实验室生物安全要求按照GB 19489执行。 5.1　 病原分离鉴定 5.1.1　 仪器和设备 5.1.1.1　 高速冷冻离心机。 5.1.1.2　 恒温培养箱。 5.1.2　 试剂或材料 5.1.2.1　 青链霉素（青霉素10 000 IU/mL，链霉素10 000 µg/mL）。 5.1.2.2　 0.22 µm微孔滤器。 5.1.2.3　 8日龄～9日龄鸭新型呼肠孤病毒抗体阴性鸭胚。 5.1.3　 病料处理 按NY/T 541要求无菌采集发病鸭的脾脏1 g～2 g，加入10倍体积生理盐水和终浓度2 000 IU/mL的青链霉素，剪碎后充分研磨，反复冻融2次～3次，8 000×g离心20 min，取上清液用0.22 µm微孔滤器过滤，经菌检无菌后用于病原分离。 5.1.4　 操作步骤 5.1.4.1　 取5.1.3中处理好的上清液经尿囊腔接种8日龄～9日龄鸭新型呼肠孤病毒抗体阴性鸭胚，0.1 mL/枚，共5枚。封口后置于37 ℃恒温箱继续孵化，每日照胚两次，记录鸭胚死亡情况，观察到第6天。 5.1.4.2　 弃掉接种后24 h内死亡的鸭胚，若接种6天内鸭胚出现死亡，则收集死亡鸭胚的尿囊液，用5.2、5.3、5.4中的任意一种方法进行鉴定；若接种6天内鸭胚不出现死亡，则收集6天活胚的尿囊液，用5.2、5.3、5.4中的任意一种方法进行鉴定。 5.1.5　 结果判定 5.1.5.1　 阳性：接种后死亡鸭胚或接种后6天活胚的尿囊液用5.2、5.3、5.4中的任意一种方法检测为阳性。 5.1.5.2　 阴性：接种后死亡鸭胚或接种后6天活胚的尿囊液用5.2、5.3、5.4中的任意一种方法检测为阴性。 5.2　 RT-PCR方法 5.2.1　 仪器和设备 5.2.1.1　 高速冷冻离心机。 5.2.1.2　 PCR扩增仪。 5.2.1.3　 电泳仪。 5.2.1.4　 紫外分析仪。 5.2.2　 试剂或材料 5.2.2.1　 TRIZol。 5.2.2.2　 无RNA酶水。 5.2.2.3　 反转录酶M-MLV。 5.2.2.4　 RNA酶抑制剂。 5.2.2.5　 Taq酶。 5.2.2.6　 琼脂糖。 5.2.2.7　 Goldview DNA染料。 5.2.2.8　 阳性参照物（鸭新型呼肠孤病毒）。 5.2.2.9　 阴性参照物（阴性尿囊液）。 5.2.3　 操作步骤 5.2.3.1　 样品处理 按NY/T 541要求无菌采集发病鸭的脾脏1 g～2 g，加入10倍体积生理盐水，用剪刀剪碎后，置于研磨器中充分研磨，反复冻融2次～3次，8 000×g离心10 min，取上清液100 μL用于RNA提取。 5.2.3.2　 RNA提取 5.2.3.2.1　 在100 µL病料上清液中加入1 mL TRIZol，剧烈颠倒50次～100次，室温静置10 min后，加入200 µL氯仿，上下颠倒50次～100次，室温静置5 min～10 min，12 000×g离心10 min。 5.2.3.2.2　 吸取上清加入等体积氯仿，上下颠倒50次～100次，12 000×g离心10 min。 5.2.3.2.3　 吸取上清加入等体积的异丙醇，轻轻混匀后，-20 ℃静置至少30 min，然后12 000×g离心15 min～20 min。 5.2.3.2.4　 弃上清液，加入1 mL 75 %酒精，12 000×g离心5 min～10 min。 5.2.3.2.5　 弃上清液，倒置自然晾干，或12 000×g再离心5 min，吸掉管底部的液体。 5.2.3.2.6　 沉淀用20 µL无RNA酶水溶解，备用。阳性和阴性参照物RNA的提取同上。样品RNA提取也可使用同等效果的商品化试剂盒。 5.2.3.3　 引物 上游引物P1：5' TCATTCATTTGGGCAGCGG 3' 下游引物P2：5' AGTAGTGTGTAAAGCATGGACT 3' 5.2.3.4　 RT-PCR扩增 5.2.3.4.1　 反转录（RT）反应 反应体系为10 µL。在PCR管中加入dNTP(10 mmol/L) 0.8 µL，引物P1(20 µmol/L) 0.5 µL，引物P2(20 µmol/L) 0.5 µL，RNA 5.0 µL，放PCR仪中70 ℃作用5 min，然后取出冰浴1 min～2 min，再加入RNA酶抑制剂(40 U/µL) 0.5 µL，反转录酶M-MLV(200 U/µL) 0.7 µL，5×M-MLV buffer 2 µL，继续放PCR仪中42 ℃ 30 min，95 ℃ 2 min。 5.2.3.4.2　 PCR扩增 5.2.3.4.2.1　 反应体系 反应体系为50 µL，配制见表1。 表1　 PCR反应体系配制 反应体系中各成分 每个样品反应组分用量/µL 10×PCR buffer 4.5 20 µmol/L引物P1 0.5 20 µmol/L引物P2 0.5 RT产物 5.0 5 U/µL Taq E 0.5 ddH2O 39.0 总体积 50.0 5.2.3.4.2.2　 反应程序 采用以下反应程序进行扩增： —— 第一阶段：95 ℃ 3 min； —— 第二阶段：95 ℃ 20 s，55 ℃ 20s，72 ℃ 30 s，共进行30个循环； —— 第三阶段：72 ℃ 10 min。 RT-PCR扩增也可使用商品化的RT-PCR试剂盒，按说明书要求操作。 5.2.3.5　 电泳 取PCR扩增产物6 µL与10×上样缓冲液1 µL混合，加入到1.5 %的琼脂糖凝胶孔中，同时在旁边点样孔中加入2 000 bp Ladder Marker（分子量标准物）10 µL，以5 V/cm电压进行电泳25 min～30 min，在紫外分析仪上观察结果。 5.2.4　 结果判定 5.2.4.1　 试验成立条件 在阳性对照出现一条大小226 bp的单一条带，同时阴性对照无此条带的情况下，检测结果成立。 5.2.4.2　 结果判定 被检样品出现与阳性对照同样大小的条带时，判为阳性；被检样品未出现与阳性对照同样大小的条带时，判为阴性。参见附录A。 5.3　 荧光RT-PCR方法 5.3.1　 仪器与设备 5.3.1.1　 高速冷冻离心机。 5.3.1.2　 荧光定量PCR扩增仪。 5.3.2　 试剂或材料 5.3.2.1　 TRIZol。 5.3.2.2　 无RNA酶水。 5.3.2.3　 SYBR Green荧光RT-PCR反应液（2×SYBR Premix）。 5.3.2.4　 阳性参照物（鸭新型呼肠孤病毒）。 5.3.2.5　 阴性参照物（阴性尿囊液）。 5.3.3　 操作步骤 5.3.3.1　 样品处理 参见5.2.3.1。 5.3.3.2　 RNA提取 参见5.2.3.2。 5.3.3.3　 引物 上游引物P3：5' ATCGCACTATTGACGCACTT 3' 下游引物P4：5' TTGACGACGCCAATCCC 3' 5.3.3.4　 荧光RT-PCR扩增 5.3.3.4.1　 反转录（RT）反应 参见5.2.3.4.1。 5.3.3.4.2　 荧光PCR 5.3.3.4.2.1　 反应体系 反应体系为25.0 µL，配制见表2。 表2　 荧光PCR反应体系配制 反应体系中各成分 每个样品反应组分用量/µL 2×SYBR Premix 12.5 20 µmol/L引物P3 0.5 20 µmol/L引物P4 0.5 RT产物 1.0 ddH2O 10.5 总体积 25.0 5.3.3.4.2.2　 反应程序 采用以下反应程序进行扩增： —— 第一阶段：95 ℃ 45 s； —— 第二阶段：95 ℃ 10 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，40个循环，每次循环在72 ℃延伸时收集荧光。 荧光RT-PCR扩增也可使用商品化的Real-time RT-PCR试剂盒，按说明书操作。 反应结束后根据分析软件得出的Ct值和扩增曲线来判定结果。 5.3.4　 结果判定 5.3.4.1　 试验成立条件 在阳性对照的Ct值≤33且出现典型扩增曲线，阴性对照Ct值≥35的情况下，试验成立。 5.3.4.2　 结果判定 当被检样品Ct值≤33且出现典型扩增曲线时，判为阳性；当被检样品无Ct值或者Ct值≥35时，判为阴性；当被检样品Ct值在33-35之间时判为可疑，需重做，再次检测结果的Ct值＜35，且出现典型扩增曲线，则判为阳性，否则判为阴性。参见附录B。 5.4　 RT-LAMP方法 5.4.1　 仪器与设备 5.4.1.1　 高速冷冻离心机。 5.4.1.2　 水浴锅。 5.4.1.3　 紫外分析仪。 5.4.2　 试剂或材料 5.4.2.1　 TRIZol。 5.4.2.2　 无RNA酶水。 5.4.2.3　 甜菜碱（betaine）。 5.4.2.4　 TritonX-100。 5.4.2.5　 反转录酶AMV。 5.4.2.6　 RNA