DB37T 3787-2019 水质 粪大肠菌群测定 光度法.doc

ICS 13.060 Z 16       DB37 山东省地方标准 DB37/T 3787—2019       水质　粪大肠菌群测定　光度法 Water quality—determination of fecal coliforms—photometric method 2019 - 12 - 24发布 2020 - 01 - 24实施 山东省市场监督管理局   发布 DB37/T 3787—2019 目  次 前言 II 1　范围 1 2　规范性引用文件 1 3　术语和定义 1 4　分光光度法 1 5　荧光法 4 前  言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省生态环境厅提出并组织实施。 本标准由山东省环保标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省生态环境监测中心、青岛佳明测控科技股份有限公司、北京华夏科创仪器 股份有限公司。 本标准主要起草人：李恒庆、由希华、宗雪梅、王婷、王聪、郑琳琳、邹康、潘光、周成、张芳、张爱芳。 6 水质　粪大肠菌群测定　光度法 1　 范围 本标准规定了测定水中粪大肠菌群的分光光度法和荧光法。 本标准适用于地表水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的应急现场快速测定。 本方法的检出限为30 MPN/L，检测范围：30～109 MPN/L，检测周期不大于18 h。 2　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 14581　水质　湖泊和水库采样技术指导 HJ/T 91　地表水和污水监测技术规范 HJ 494　水质　采样技术指导 3　 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1　 粪大肠菌群　fecal coliforms 44.5 ℃培养能发酵乳糖产酸产气的需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。 3.2　 最大可能数　most probable number，MPN 最大可能数（most probable number，缩写为MPN），又称稀释培养计数，是一种基于泊松分布的间接计数法。利用统计学原理，根据一定体积不同稀释度样品经培养后产生的目标微生物阳性数，查表估算一定体积样品中目标微生物存在的数量（单位体积存在目标微生物的最大可能数）。 4　 分光光度法 4.1　 方法原理 一定量的水样与选择性培养基混合均匀放置于44.5 ℃环境下，粪大肠菌群产生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase），并分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，通过连续分光光度（波长：300 nm～600 nm）测定，依据待测水样色度变化与水中粪大肠菌群数成一定关系的原理，得出粪大肠菌群浓度。 4.2　 干扰和消除 4.2.1　 活性氯具有氧化性，能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集（4.5.1）时加入硫代硫酸钠溶液（4.3.4）消除干扰。 4.2.2　 重金属离子具有细胞毒性，能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集（4.5.1）时加入乙二胺四乙酸二钠溶液（4.3.5）消除干扰。 4.3　 试剂和材料 除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂。 4.3.1　 粪大肠菌群检测试剂主要成分： —— 蛋白胨：5 g； —— 硫酸锰：0.005 g； —— 硫酸镁：0.001 g； —— 硫酸锌：0.001 g； —— 磷酸盐：1.78 g； —— 两性霉素B：0.60 g； —— 蒸馏水1 000 mL。 制法：上述试剂溶于蒸馏水中，充分混匀，调整pH值为7.2～7.4，68.95 kPa(115 ℃)，高压灭菌20 min，分装贮存于4 ℃避光备用。 注： 也可采用市售商品化培养基制品。 4.3.2　 硫代硫酸钠（Na2S2O3•5H2O）。 4.3.3　 乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2O8Na2•2H2O）。 4.3.4　 硫代硫酸钠溶液：ρ（Na2S2O3）=0.10 g/mL，称取15.7 g硫代硫酸钠（4.3.2），溶于适量水中，定容至100 mL，临用现配。 4.3.5　 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液：ρ（C10H14N2O8Na2•2H2O）=0.15 g/mL，称取15 g乙二胺四乙酸二钠（4.3.3），溶于适量水中，定容至100 mL，此溶液保质期为30 d。 4.3.6　 无菌水：取适量纯水，经121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，备用。 4.4　 仪器和设备 4.4.1　 采样瓶：具螺旋帽或磨口塞的100 mL、250 mL、500 mL广口玻璃瓶。 注： 在采集不存在或不考虑余氧、金属离子干扰的样品时，可采用市售无菌采样瓶或无菌采样袋。 4.4.2　 微生物快速检测仪： —— 恒温培养单元：不少于2个温控系统，温度控制精度1 ℃，可自动调节待检测样本培养温度（44.5 ℃±1 ℃）； —— 检测单元：不少于4个独立的检测系统，可实现多个样本的同时监测； —— 数据显示、处理单元：自动输出检测结果，可查询和显示历史数据。 4.4.3　 高压蒸汽灭菌器：121 ℃可调、101.3 kpa。 4.4.4　 量筒：50 mL、100 mL。 4.4.5　 移液管：1 mL、10 mL。 4.4.6　 天平：感量0.01 g。 注： 移液管、采样瓶等玻璃器皿及采样器具试验前应按无菌操作要求包扎，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，烘干，备用。 4.5　 样品 4.5.1　 样品采集 点位布设及采样频次按照GB/T 14581、HJ 494和HJ/T 91的相关规定执行。 与其它项目一同采样时，先单独采集微生物样品，采样瓶（4.4.1）不得用水样洗涤，采集水样于灭菌的采样瓶中。 采集河流、湖库等地表水样时，可握住瓶子下部直接将带塞采样瓶插入水中，约距水面10 cm～15 cm处，瓶口朝水流方向，拔玻璃塞，使水样灌入瓶内然后盖上瓶塞，将采样瓶从水中取出。如果没有水流，可握住瓶子水平往前推。采样量一般为采样瓶容量的80%左右。采好水样后，迅速扎上无菌包装纸。 采集地表水、废水样品及一定深度的水样时，可使用灭菌过后专用采样装置采样。 在同一采样点进行分层采样时，应自上而下进行，避免不同层次的搅扰。 如果采集的是含有活性氯的样品时，需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸钠溶液（4.3.4），以除去活性氯对细菌的抑制作用(每125 mL容积加入0.1 mL的硫代硫酸钠溶液)；如果采集的是重金属离子含量较高的样品，则在采样瓶灭菌前加入乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液（4.3.5），以消除干扰（每125 mL容积加入0.3 mL的乙二胺四乙酸二钠溶液）。 注： 15.7 mg硫代硫酸钠(4.3.2)可去除样品中1.5 mg活性氯，硫代硫酸钠用量可根据样品实际活性氯量调整。 4.5.2　 样品保存 采样后应在2 h内检测，否则，应10 ℃以下冷藏但不得超过6 h。实验室接样后，不能立即开展检测的，将样品于4 ℃以下冷藏并在2 h内检测。 4.6　 分析步聚 4.6.1　 接种 接种待测水样于装有5 mL培养基的检测瓶中，定容至20 mL，水样与培养基应充分混匀。 4.6.2　 培养 打开仪器电源开关，待仪器稳定30 min后，将接种后的检测瓶放置于微生物快速检测仪中，按照仪器说明书进行操作，设置检测温度为44.5 ℃，点击“检测”按钮，2～18小时，仪器自动培养得出结果。 4.6.3　 对照试验 4.6.3.1　 空白对照 采用无菌水（4.3.6）作为待测水样按照本标准4.6.1～4.6.2进行空白测定，测试结果不得检出，否则该次样品测定结果无效，应重新测定空白以及待测样品。 4.6.3.2　 阴性及阳性对照 粪大肠菌群的阴性、阳性菌株参考表1。 表1　 阴性、阳性菌株参照表 检测指标 阳性菌种 阴性菌种 粪大肠菌群 大肠埃希氏菌（耐热型）、克雷伯氏菌属(Klebsiella trevisan)（耐热型） 产气肠杆菌、粪链球菌 (Streptococcus faecalis)、假单胞菌属 将标准菌株制成300～3 000个/mL的菌悬液，将菌悬液按接种（4.6.1）和培养（4.6.2）要求操作，阳性菌株应呈现阳性反应；阴性菌株呈现阴性反应，否则，该次样品测定结果无效，应重新测定。 注： 可先制备较高浓度菌悬液，采用血球计数器在显微镜下对其浓度进行初步测定，再根据实际情况用无菌水(4.3.6)稀释至300 MPN/mL～3 000 MPN/mL。 4.7　 结果计算与表示 微生物快速检测仪自动计算检测结果，结果以科学计数方法表示。 4.8　 精密度和准确度 微生物检测数据为偏态分布，按其统计分析要求，其检测所得结果全部经对数（以10为底）转换后进行以下分析。 4.8.1　 精密度 6家实验室对粪大肠菌群有证标准样品（7 620 MPN/L）进行测定： 实验室内相对标准偏差为1.92 %～4.77 %，实验室间相对标准偏差为3.98 %，重复性限为0.32，再现性限为0.52。 6家实验室对3个不同浓度实际样品（浓度为107 MPN/L、105 MPN/L、103 MPN/L）进行测定： 实验室内的相对标准偏差范围分别为：0.64 %～2.36 %、1.07 %～3.06 %、2.42 %～6.81 %，实验室间的相对标准偏差分别为：0.91 %、0.89 %、2.64 %，重复性限为0.34、0.35、0.49，再现性限为0.36、0.35、0.52。 4.8.2　 准确度 6家实验室分别对有证标准菌株（所使用的标准菌株浓度为7 620 MPN/L）进行测定，相对误差为：-8.24 %～1.43 %，相对误差的最终值为：-3.56 %±7.82 %。 4.9　 质量保证和质量控制 4.9.1　 每批样品按对照试验（4.6.3）进行空白对照测定，定期使用有证标准菌株进行阳性、阴性对照试验。 4.9.2　 每批次实验取待测水样数量的10 %，做双样分析，检测结果以双样平均值计。 4.9.3　 对每批次培养基应使用有证标准菌株进行培养基质量检验。 4.9.4　 按有证标准菌株保存条件的要求，严格控制质量。 4.10　 废弃物的处理 实验产生的废弃物经121 ℃高压蒸汽灭菌20 min后，作为一般废物处理。 5　 荧光法 5.1　 方法原理 一定量的水样与选择性培养基混合均匀放置于44.5 ℃环境下，粪大肠菌群产生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase），并分解β-半乳糖苷释放出荧光。疏水的荧光产物聚合至光学检测区，通过光度计（波长：350 nm～650 nm）测定，依据荧光强度与水中粪大肠菌群数成一定关系的原理，从而得出粪大肠菌群浓度。 5.2　 干扰和消除 按本标准4.2条进行。 5.3　 试剂和材料 除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂。 5.3.1　 粪大肠菌群检测试剂主要成分： —— 聚合氨基酸1.3 g； —— 氯化钠0.34 g； —— 磷酸盐0.36 g。 制法：聚合氨基酸、氯化钠和磷酸盐，3种固体粉末至于容器中充分混匀，115 ℃高压灭菌20 min，贮存于4 ℃避光备用。 注： 也可采用市售商品化培养基制品。 5.3.2　 硫代硫酸钠（Na2S2O3•5H2O）。 5.3.3　 乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2O8Na2•2H2O）。 5.3.4　 硫代硫酸钠溶液：同4.3.4。 5.3.5　 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液：同4.3.5。 5.3.6　 无菌水：同4.3.6。