DB37T 3673-2019 牡蛎疱疹病毒制型检测技术规范 巢式PCR法.doc

ICS 11.220 B 41       DB37 山东省地方标准 DB 37/T 3673—2019       牡蛎疱疹病毒І型检测技术规范　巢式PCR法 Ostreid herpesvirus-1 Detection Specification- Nested PCR 2019 - 08 - 30发布 2019 - 09 - 30实施 山东省市场监督管理局   发布 DB37/T 3673—2019 目  次 前  言 II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和缩略语 1 3.1 术语和定义 1 3.2 缩略语 1 4 试剂及仪器 1 4.1 试剂 2 4.2 仪器 2 5 采样 3 5.1 采样对象 3 5.2 采样数量、方法和保存运输 3 5.3 样品的采集 3 6 检测 3 6.1 DNA的提取 3 6.2 巢式PCR操作步骤 3 6.3 电泳及测序 4 7 结果 4 7.1 结果判定 4 7.2 结果表述 4 附　录　A （规范性附录） 试剂及配制方法 5 附　录　B （资料性附录） 检测目的片段的DNA序列及电泳图 7 前  言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由山东省农业农村厅提出并监督实施。 本标准由山东省渔业标准化技术委员会(鲁TC 03)归口。 本标准起草单位：山东农业大学、济宁滨阳生物科技股份有限公司、泰安益海生物科技有限公司、泰安智博生物科技有限公司、南京根洋生物科技有限公司、南京少伯生物科技有限公司、南京福海生物科技有限公司。 本标准起草人：王雪鹏、丁雷、闫现广、王方鹏、郭志明、孙永灿、付天增、姜衡、黄金菁。 6 牡蛎疱疹病毒І型检测技术规范　巢式PCR法 1　 范围 本标准规定了牡蛎疱疹病毒І型（Ostreid herpesvirus-1，OsHV-1）的巢式PCR检测方法，适用于对贝类样品进行疱疹病毒І型带毒情况的定性检测，以进行牡蛎疱疹病毒І型的流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法 SC/T 7205.1　牡蛎包纳米虫病诊断规程 3　 术语和缩略语 3.1　 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1　 牡蛎疱疹病毒І型 牡蛎疱疹病毒І型属于软体动物疱疹病毒科（Malacoherpesviridae）、牡蛎疱疹病毒属（Ostreavirus），是一种双链DNA病毒，在世界范围内广泛流行，主要危害牡蛎、扇贝和魁蚶等多种双壳贝类，对贝类养殖业造成重大的损害。 3.2　 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对（base pair） dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） EB：溴化乙啶（ethidium bromide） EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid） PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） Taq：水生栖热菌（thermus aquaticus） TE：Tris盐酸和EDTA缓冲液（EDTA Tris·HCl） Tris：三羟甲基氨基甲烷（tris hydroxymethyl aminomethane） 4　 试剂及仪器 4.1　 试剂 4.1.1　 除非另有说明，实验用水均为GB/T 6682规定的三级水或相当纯度的水。 4.1.2　 无水乙醇：分析纯。 4.1.3　 TE缓冲液按附录A.1的规定。 4.1.4　 抽提缓冲液按附录A.2的规定。 4.1.5　 蛋白酶K按附录A.3的规定。 4.1.6　 10 mol/L乙酸铵按附录A.4的规定。 4.1.7　 Tirs饱和酚（pH≥7.8）：分析纯。 4.1.8　 4.1.8 酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)：分析纯。 4.1.9　 4.1.9 氯仿/异戊醇(24:1)：分析纯。 4.1.10　 50×TAE：见附录A.5，也可以直接购买市售产品。 4.1.11　 1×TAE：见附录A.5。 4.1.12　 70 %乙醇按附录A.6的规定。 4.1.13　 dNTP（各2.5 mmol/L）：生化试剂，含dATP、dTTP、dGTP、dCTP各2.5 mmol/L的混合物，-20 ℃保存，用于PCR。 4.1.14　 10×PCR反应缓冲液：见附录A.7，也可以直接购买市售产品。 4.1.15　 MgCl2 (25 mmol/L)：生化试剂，-20 ℃保存。 4.1.16　 Taq DNA聚合酶(5 U/μL)：生化试剂，-20 ℃保存。 4.1.17　 外引物CF：5’-ATTACCCAGATTCCCCTC-3’，-20 ℃保存。 4.1.18　 外引物CR：5’-CCACAAATGTAAACTGTGAC-3’，-20 ℃保存。 4.1.19　 内引物C3：5’-GTGTTCTATACCATACGACCTACA-3’，-20 ℃保存。 4.1.20　 内引物C2：5’-TTGCGTTCCGTGACTTCT-3’-20 ℃保存。 4.1.21　 PCR检测阳性对照：已知受牡蛎疱疹病毒І型感染的贝类组织样品，-80 ℃保存。 4.1.22　 PCR检测阴性对照：已知未受牡蛎疱疹病毒І型感染的贝类组织样品，-80 ℃保存。 4.1.23　 PCR检测空白对照以灭菌双蒸水作模板。 4.1.24　 琼脂糖：分析纯。见附录A.8。 4.1.25　 6×Loading Buffer：附录A.9，也可以直接购买市售产品。 4.1.26　 DNA分子量标准。 4.1.27　 溴化乙锭（EB）：分析纯，10 mg/mL，见A.10，或其他等效产品。 4.2　 仪器 4.2.1　 离心机。 4.2.2　 PCR仪。 4.2.3　 电泳仪。 4.2.4　 水平电泳槽。 4.2.5　 凝胶成像系统或紫外仪。 4.2.6　 多功能振荡器。 4.2.7　 水浴锅或金属浴。 4.2.8　 -20 ℃普通冰箱。 4.2.9　 –80 ℃超低温冰箱。 4.2.10　 微波炉电炉或其他加热设备。 4.2.11　 微量移液器：量程0.5 μL～1 000 μL。 5　 采样 5.1　 采样对象 牡蛎、扇贝和魁蚶等易感双壳贝类。 5.2　 采样数量、方法和保存运输 采样数量、方法和保存运输应符合SC/T 7205.1的要求。 5.3　 样品的采集 稚贝（附着后～2 mm）和幼贝（2 mm～3 cm）取内脏团；成贝（＞3 cm）取外套膜和斧足。 样品采集后分别置于1.5 mL离心管中，立即进行DNA提取操作或暂时保存于-20 ℃。 6　 检测 6.1　 DNA的提取 6.1.1　 取30 mg～50 mg组织样品，加入抽提缓冲液500 μL，充分研磨，37 ℃温浴1 h。提取过程同时设置阳性对照、阴性对照、空白对照。 6.1.2　 加入2.5 μL 20 mg/mL蛋白酶K，至终浓度100 μg/mL，混匀后置于50 ℃水浴3 h，不时旋动。 6.1.3　 将溶液冷却至室温，加入等体积平衡酚，颠倒混合10 min，于10 000 r/min离心3 min分离两相。 6.1.4　 水相移至新1.5 mL离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，颠倒混合10 min，于10 000 r/min离心1 min分离两相。 6.1.5　 水相移至一新1.5 mL离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，颠倒混合10 min，于10 000 r/min离心1 min分离两相。 6.1.6　 水相移至一新1.5 mL离心管中，加入100 μL 10 mol/L乙酸铵，混匀后，再加入两倍体积预冷无水乙醇(-20 ℃)混匀，-20 ℃放置2 h。10 000 r/min离心10 min，弃上清。 6.1.7　 用70 %乙醇洗涤沉淀2次，每次10 000 r/min离心5 min，倾去上清，沉淀于室温晾干。 6.1.8　 加入100 μL灭菌双蒸水溶解DNA。 6.1.9　 若DNA样品需要保存，可溶解于100 μL TE缓冲液中并保存于-20 ℃。 6.1.10　 可以采用同等抽提效果的其他方法或使用商品化DNA抽提试剂盒。 6.2　 巢式PCR操作步骤 6.2.1　 第一步反应体系及反应扩增程序 PCR反应体系如表1所示（25 μL反应体系）。阳性样品：牡蛎疱疹病毒І型DNA；阴性样品：健康双壳贝类组织DNA；空白对照：超纯水；检测样品：待检测样品组织DNA。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 sec、46 ℃退火30 sec、72 ℃延伸1 min，32个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保温。 表1　 25 μL反应体系所加试剂 名称 浓度 体积 PCR反应缓冲液 10.0× 2.5 μL 表1　25 μL反应体系所加试剂（续） 名称 浓度 体积 dNTPs 2.5 mM 2.0 μL CF 25.0μM 0.5 μL CR 25.0μM 0.5 μL Taq DNA 聚合酶 5.0 U/μL 0.5 μL 基因组DNA 100.0 ng/μL 1.0 μL 超纯水 18.0 μL 合计 25.0 μL 6.2.2　 第二步反应体系及反应扩增程序 取6.2.1中PCR扩增产物稀释100倍作为模板，以内引物C3、C2为引物进行PCR扩增，反应体系成分同第一步扩增反应。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 sec、48 ℃退火30 sec、72 ℃延伸35 sec，32个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保温。 6.3　 电泳及测序 6.3.1　 配制1.5 %的琼脂糖凝胶，加入10 mg/mL EB 至终浓度0.5 μg/mL，摇匀。制备琼脂糖凝胶。 6.3.2　 将5 μL PCR反应产物与1 μL 6×载样缓冲液混匀后加入到加样孔中。同时设立DNA分子量标准对照。 6.3.3　 在1 V/cm～5 V/cm的电压下电泳，使DNA由负极向正极移动。当载样缓冲液中的溴酚蓝指示剂的色带迁移至琼脂糖凝胶的1/2 ～ 2/3处时停止电泳，将凝胶置于紫外观察仪或凝胶成像仪下观察或拍照。 6.3.4　 如果观察到结果阳性，对PCR扩增产物进行测序。 7　 结果 7.1　 结果判定 阳性对照在657 bp处出现条带，阴性对照在657 bp处不出现条带，空白对照不出现任何条带，判断为本批检测结果可靠（如图1所示）。阳性对照未在657 bp处出现条带，或阴性对照在657 bp处出现条带，判断为本批检测失败，需查找原因，重新取样检测。检测样品在657 bp处有条带，测序结果同参考序列（参见附录B）进行比较，若序列符合可判断待测样品为牡蛎疱疹病毒І型PCR阳性；当检测样本无条带或条带大小与阳性对照的扩增条带大小不一致，报告结果为阴性。 7.2　 结果表述 阳性结果报告为该贝类样本中存在牡蛎疱疹病毒І型DNA。阴性结果报告为该贝类样本中不存在牡蛎疱疹病毒І型DNA。 A A 附　录　A （规范性附录） 试剂及配制方法 A.1　 TE缓冲液(pH8.0) 1