DB37T 3676-2019 种猪场伪狂犬病净化技术规范.doc

ICS 65.020.30 B 41       DB37 山东省地方标准 DB 37/T 3676—2019       种猪场伪狂犬病净化技术规范 Technical Regulation of Eradication of Pseudorabies in Swine BreedingFarms 2019 - 08 - 30发布 2019 - 09 - 30实施 山东省市场监督管理局   发布 DB37/T 3676—2019 目  次 前言 III 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 检测方法 2 4.1 仪器 2 4.2 耗材 2 4.3 试剂 2 4.4 核酸检测 2 4.5 血清学检测 2 5 净化群的建立 3 5.1 净化策略 3 5.2 感染状况普查阶段 3 5.3 强化免疫阶段 3 5.4 检测与淘汰阶段 4 5.5 强制净化阶段 4 5.6 假定健康阶段 4 5.7 净化场的评估阶段 4 6 净化场的维持阶段 4 6.1 免疫 5 6.2 监测 5 6.3 引种检疫 5 6.4 生产记录不佳的种猪检测 5 7 综合生物安全措施 5 7.1 合理的猪场选址 5 7.2 生产模式 5 7.3 饲养管理 5 7.4 消毒措施 5 7.5 无害化处理措施 6 7.6 有害生物防治措施 6 7.7 其它生物安全措施 6 7.8 档案管理 6 附　录　A （资料性附录） 猪伪狂犬病免疫无疫评估实验室检测方法及抽样要求 7 附　录　B （资料性附录） 猪伪狂犬病净化评估实验室检测方法及抽样要求 8 前  言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省动物疫病预防与控制中心、山东省畜牧总站、山东汇众兽医科技服务公司。 本标准主要起草人：李云岗、张栋、张月、周开锋、楚遵峰、汪洋、王士荣、王敏、曹振山、刘波。 7 种猪场伪狂犬病净化技术规范 1　 范围 本标准规定了种猪场猪伪狂犬病净化的检测方法、净化群的建立、净化场的维持及综合生物安全措施。 本标准适用于种猪场猪伪狂犬病净化。 2　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 17823　集约化猪场防疫基本要求 GB/T 17824.2　规模猪场生产技术规程 GB/T 18641　伪狂犬病诊断技术 GB/T 35911　伪狂犬病病毒荧光PCR检测方法 NY/T 1168　畜禽粪便无害化处理技术规范 NY/T 1568　标准化规模养猪场建设规范 DB37/T 2384　种猪场消毒技术规范 《病死及病害动物无害化处理技术规范》　农医发〔2017〕25号 《跨省调运乳用种用动物产地检疫规程》　农牧发〔2019〕2号 3　 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1　 伪狂犬病　Pseudorabies 伪狂犬病是由疱疹病毒科疱疹病毒Ⅰ型伪狂犬病毒（PRV）引起的猪及多种家畜和野生动物的传染病。 3.2　 净化　eradication 对种猪场采取一系列措施，达到消灭和清除猪伪狂犬病的过程。在某一限定的种猪场内，根据猪伪狂犬病的监测结果，及时发现并淘汰感染猪只，使种猪群中猪伪狂犬病逐渐被清除的疫病控制方法。 3.3　 猪伪狂犬gE基因缺失疫苗　Pseudorabies gEgene-deleted vaccine 利用猪伪狂犬gE基因缺失病毒株所制成的疫苗。 4　 检测方法 4.1　 仪器 4.1.1　 荧光PCR检测仪。 4.1.2　 PCR仪和凝胶成像系统（根据实验室条件选择，替换4.1.1）。 4.1.3　 高速台式冷冻离心机：可控温至4 ℃、离心速度可达12 000 r/min 以上。 4.1.4　 组织研磨器或者研钵。 4.1.5　 普通冰箱。 4.1.6　 微量移液器：0.2 μL～2 μL，1 μL～10 μL，10 μL～100 μL，20 μL～200 μL，100 μL～1 000 μL。 4.1.7　 酶标仪。 4.1.8　 恒温箱。 4.1.9　 高压灭菌锅。 4.2　 耗材 4.2.1　 1.5 mL离心管。 4.2.2　 0.2 mLPCR薄壁管。 4.2.3　 酶标板,移液器吸头。 4.3　 试剂 4.3.1　 除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T 6682的要求。 4.3.2　 商品化DNA抽提试剂，于4 ℃保存。 4.3.3　 无水乙醇，-20 ℃预冷。 4.3.4　 75 %乙醇，无水乙醇和双蒸水配制，-20 ℃预冷。 4.3.5　 含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各10 mmol/L，-20 ℃保存，避免反复冻融。 4.3.6　 普通PCR引物参照GB/T 18641。 4.3.7　 荧光PCR引物和探针参照GB/T 35911。 4.3.8　 酶标检测试剂 等效采用PRV-gE基因缺失疫苗配套的商品化鉴别检测试剂。 4.4　 核酸检测 活猪采集扁桃体或全血，病死猪或流产胎儿采集大脑、扁桃体、淋巴结、肺脏等组织。依据GB/T 18641或GB/T 35911，使用PCR方法，检测组织中的猪伪狂犬病病毒核酸。 4.5　 血清学检测 4.5.1　 猪伪狂犬病病毒gB（PRV-gB）抗体检测 采集猪血，分离血清。采用商品化ELISA试剂盒，检测猪血清中的PRV-gB 抗体，评估免疫抗体水平。 4.5.2　 猪伪狂犬病病毒gE（PRV-gE）特异性抗体检测 采集猪血，分离血清。采用商品化ELISA试剂盒，检测猪血清中的PRV-gE特异性抗体，评估野毒感染状态。 4.5.3　 合格免疫抗体判定标准 4.5.3.1　 个体免疫抗体合格标准，PRV-gB抗体按所选取的试剂盒判定标准执行。 4.5.3.2　 群体免疫抗体合格标准，群体PRV-gB抗体阳性率不低于90 %。 5　 净化群的建立 5.1　 净化策略 5.1.1　 采用gE基因缺失疫苗免疫、野毒鉴别诊断技术淘汰阳性感染猪的策略。 5.1.2　 适时淘汰生产成绩差的母猪。做好引种监测，每年引进的公猪和后备猪应为全阴性。 5.1.3　 综合生物安全措施保障到位。 5.2　 感染状况普查阶段 5.2.1　 采样技术 前腔静脉或扁桃体采样，并及时对血样或组织样品规范保存、送检。采血过程及制样过程要防止污染并规范标记。 5.2.2　 抽样数量 抽样要求和数量参照附录A中表A.1和表A.2进行。置信度95 %，预期流行率5 %。根据野毒抗体阳性率高低，确定具体净化方案。 5.2.3　 净化方案的确定 5.2.3.1　 血清样品PRV-gE抗体阳性率不超过10 %，实行检测淘汰-监测与认证维持的净化方案。 5.2.3.2　 血清样品PRV-gE抗体阳性率在10 %～20 %，实行强化免疫-检测淘汰-补充阴性后备猪-监测与认证维持的分步净化方案。 5.2.3.3　 血清样品PRV-gE抗体阳性率大于20 %，该猪群不具备净化条件。 5.3　 强化免疫阶段 5.3.1　 疫苗 5.3.1.1　 PRV-gE基因缺失活疫苗，免疫原性好。 5.3.1.2　 有配套的PRV野毒感染鉴别诊断试剂。 5.3.2　 免疫程序 5.3.2.1　 根据疫苗免疫后抗体跟踪检测情况确定合理的免疫程序。 5.3.2.2　 种猪，种母猪和公猪每年普免2次～3次，避免在分娩前7 d内接种。 5.3.2.3　 后备猪群，后备猪配种前8W1次活疫苗免疫 ；以后按生产种猪的免疫程序进行免疫。 5.3.2.4　 仔猪，1 d～2 d日龄滴鼻免疫。45 d活疫苗加强免疫。 5.3.3　 检测评估 免疫后3W检测gB抗体和gE抗体。当gE抗体阴性时，如果90 %的样品gB抗体阳性，即可认为群体免疫合格。 5.3.4　 临床评估 通过强化免疫后，猪群应无猪伪狂犬病的临床症状。 5.4　 检测与淘汰阶段 5.4.1　 隔离淘汰 每半年进行一次血清学检查，全群采样。阴、阳性猪分群饲养。逐步淘汰和缩小阳性猪群。加强阴性群的隔离与监测，最后建立完全健康的gE阴性猪群。 5.4.2　 种猪群的检测与淘汰 当种猪群样品的伪狂犬病野毒感染抗体（gE抗体）阳性率在10 %以下时，如gE抗体阳性，应直接淘汰；对可疑样品再次检测，也可在10 d～14 d后再抽样复核，如仍为可疑，应直接淘汰。 5.4.3　 后备种猪的检测与淘汰 对拟选留的后备种猪，可分别在5月龄（或进入后备舍）和配种前1个月检测gE抗体，如为阴性，即可作为种猪使用；gE抗体阳性或两次可疑，应淘汰处理。 5.5　 强制净化阶段 5.5.1　 对全群猪只进行检测，剔除全部阳性猪只。 5.5.2　 在最后1头阳性猪淘汰1个月后，对种公猪按100 %比例、母猪按10 %比例采血，再次进行PRV-gE 特异性抗体检测。 5.5.3　 如抽检种猪群PRV-gE抗体全部阴性且群体90 %的样品为gB抗体阳性可视为假定猪伪狂阴性群。 5.6　 假定健康阶段 在最后1头阳性猪淘汰后1年内，种猪群PRV-gE抗体阴性；生产成绩正常稳定。猪群则进入假定健康阶段。 5.7　 净化场的评估阶段 5.7.1　 评估时间 在进入“假定健康阶段”后，按照免疫无疫标准、净化标准进行净化场评估。 5.7.2　 免疫无疫标准 5.7.2.1　 生产母猪和后备种猪抽检,猪伪狂犬病病毒gB抗体阳性率不低于90 %。 5.7.2.2　 种公猪、生产母猪和后备种猪抽检，猪伪狂犬病病毒gE抗体检测均为阴性。 5.7.2.3　 连续两年以上无临床病例。 5.7.3　 净化标准 5.7.3.1　 种公猪、生产母猪和后备种猪抽检，猪伪狂犬病病毒gE抗体检测均为阴性。 5.7.3.2　 停止免疫两年以上,无临床病例。 5.7.4　 评估抽样 评估专家小组负责设计抽样方案并监督抽样。样本方案和检测方法参照附录A、附录B。置信度95 %，预期流行率3 %。 6　 净化场的维持阶段 6.1　 免疫 种猪场要制定并实施合理的免疫程序，选用合格的猪伪狂犬病gE基因缺失疫苗，按照免疫程序进行免疫接种。 6.2　 监测 6.2.1　 种猪群检测 每年对阴性种猪群，监测PRV-gE抗体。抽样比例参考表A.1。置信度95 %，预期流行率3 %。保证基础群、后备群维持阴性状态。 6.2.2　 后备猪的检测 在后备猪选留时进行PRV-gE特异性抗体和PRV-gB免疫抗体检测，确保转入种猪群的猪只PRV-gE抗体为阴性，PRV-gB免疫抗体水平应符合合格标准。后备猪入群必须逐头检测。 6.3　 引种检疫 6.3.1　 严格检疫引进猪只。按照农牧发〔2019〕2号《跨省调运乳用种用动物产地检疫规程》规定引进猪只。 在种猪启运前对拟引进猪只逐头进行检测，确保PRV-gE特异性抗体阴性或猪伪狂犬病病毒核酸检测阴性，且PRV-gB抗体合格后方可启运引进。 6.3.2　 建立专门隔离饲养舍，引进后隔离饲养45 d以上经检测合格后才可混群饲养。 6.3.3　 使用外来种公猪的精液时，必须在购买前对供精种公猪进行严格检疫，保证供精种公猪PRV-gE 特异性抗体阴性或猪伪狂犬病病毒核酸检测阴性且 PRV-gB 免疫抗体合格。对精液进行病原核酸检测确保检测结果阴性。 6.4　 生产记录不佳的种猪检测 要及时收集病死猪及母猪所生