DB37T 3690.1-2019 液体菌种制备技术规程 第1部分：香菇.doc

ICS 65.020.20 B 05       DB37 山东省地方标准 DB 37/T 3690.1—2019       液体菌种制备技术规程　第1部分：香菇 Technical specifications for the preparation of liquid spawn—part1：Lentinula edodes 2019 - 09 - 20发布 2019 - 10 - 20实施 山东省市场监督管理局   发布 DB37/T 3690.1—2019 目  次 前言 II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 基本要求 3 4.1 人员要求 3 4.2 产地环境要求 3 4.3 生产设备与设施 3 5 生产技术 3 5.1 工艺流程 3 5.2 品种选择 4 5.3 母种活化 4 5.4 摇瓶液体菌种生产 4 5.5 发酵罐液体菌种生产 5 5.6 贮藏 6 6 生产档案 7 附　录　A （规范性附录） 香菇液体菌种生产记录事项 8 前  言 本标准依据GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。 本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业技术推广总站、泰安市农业科学研究院、山东七河生物科技股份有限公司、山东惠民齐发果蔬有限责任公司。 本标准主要起草人：赵淑芳、高瑞杰、高中强、王庆武、高霞、司元明、张燕、崔慧、吴元元、崔晓、张晓雱、王晓婷、林雪、崔艳秋、李霄、黄雪、苏建昌、孙振福、张振宇、李欣。 8 液体菌种制备技术规程　第1部分：香菇 1　 范围 本标准规定了香菇液体菌种的术语和定义、基本要求、生产技术和生产档案管理等要求。 本标准适用于香菇液体菌种的制备。 2　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 150　压力容器 GB/T 4789.28　食品卫生微生物学检验　染色法、培养基和试剂 GB 5749　生活饮用水卫生标准 GB/T 12728　食用菌术语 GB 19170　香菇菌种 GB 50073　洁净厂房设计规范 NY/T 528　食用菌菌种生产技术规程 3　 术语和定义 GB/T 12728界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1　 食用菌液体菌种发酵罐　edible mushroom liquid strain fermenter 进行食用菌液体菌种培养的专用发酵设备，应符合GB 150要求。 3.2　 食用菌液体菌种接种器　edible mushroom liquid strain inoculator 将液体菌种按无菌操作要求接种到固体培养基物料上的工具。 3.3　 空气压缩机　air compressor 能为食用菌液体菌种发酵生产提供压缩空气的设备。 3.4　 空气过滤器　air filter 能对食用菌液体菌种发酵罐所用空气进行滤除杂菌和其他杂质，达到无菌洁净要求的设备。 3.5　 罐压　jar pressure 在液体菌种发酵制备过程中发酵罐内保持的空气压力（表压），单位：MPa。 3.6　 通气量　ventilation volume 液体菌种培养过程中发酵罐体积与每分钟通入发酵罐中无菌空气体积的比例。用 V/V（发酵罐体积/通入空气体积）表示。 3.7　 接种量　inoculation amount 菌种体积与培养基体积的比例，用百分数表示。 3.8　 液体菌种菌龄　period of liquid strain running 菌种接入培养基开始计算的液体菌种培养时间。 3.9　 发酵罐空消　empty fermenter sterilization 对尚未加水投料的空发酵罐进行高压灭菌。 3.10　 投料　feeding 将配置好的培养基投放到培养器中。 3.11　 定容　constant volume 培养器中加入培养基后，加水至所要求体积 3.12　 发酵罐实消　fermenter sterilization 指对投料后的发酵罐进行高压蒸汽灭菌。 3.13　 罐压回零　jar pressure returning to zero 液体菌种培养过程中，发酵罐内压力回到零点。 3.14　 摇瓶液体菌种　liquid spawn in flask 装至玻璃菌种瓶内在磁力搅拌器或恒温摇床上培养的液体菌种。 3.15　 培养基起始pH　initial pH value of medium 液体培养基灭菌后尚未接种时的pH。 4　 基本要求 4.1　 人员要求 工作人员应该保持个人卫生，进液体菌种发酵车间必须穿戴经灭菌处理的工作服、口罩、鞋、帽。 4.2　 产地环境要求 4.2.1　 场所要求 生产场所符合NY/T 528的环境卫生要求，场地开阔、路面硬化、卫生清洁。 4.2.2　 厂房要求 4.2.2.1　 厂房设计应符合 NY/T 528 要求，增设摇瓶菌种培养室、发酵罐菌种培养室。 4.2.2.2　 应设置与职工人数相适应的更衣室，车间入口处应设置洗手、消毒和干手设施。过道应设置风淋室。 4.2.2.3　 车间地面应能防水、防腐蚀、防渗漏、防滑，易清洗，有适当的排水坡度（1.0°～1.5°）和良好的排水系统。 4.2.2.4　 墙壁和天花板应能防潮、防霉、防水。 4.2.2.5　 门窗应设置防蚊蝇纱网。 4.2.2.6　 车间安装排气管道或者排风设备。 4.2.2.7　 液体菌种接种间应设置缓冲间。 4.2.2.8　 摇瓶菌种培养室、发酵罐菌种培养室应符合 GB 50073要求。 4.2.2.9　 车间设封闭式废物桶。 4.3　 生产设备与设施 4.3.1　 生产设备与用具 应具有磅秤、天平、高压蒸汽灭菌锅、发酵罐、液体菌种接种器、超净工作台、调温设备、除湿设备、恒温培养箱、恒温摇床或磁力搅拌器、冰箱、显微镜等及常规用具。压力容器应经政府有关部门检验合格，符合GB 150要求。应具有备用电源。 4.3.2　 基本设施 培养基配制室、摇瓶菌种培养室、发酵罐菌种培养室规模要配套，布局合理，其中培养基配制室空间洁净度应达到万级以上，摇瓶菌种培养室、发酵罐菌种培养室要有调温设施，空间洁净度应达到百级。菌种检验室和母种制作室要有相应的实验检测设备和制种用的灭菌设施和常规用具。 5　 生产技术 5.1　 工艺流程 工艺流程见图1。 发酵培养 无菌空气 摇甁液体菌种 母种活化 基质 培养基配制 投料 灭菌 发酵罐液体菌种 发酵罐空消 接种 图1　 香菇液体菌种生产工艺流程 5.2　 品种选择 选用高产、优质、抗逆性强、商品性好的香菇品种，从具有相应资质的供种单位引种且种性清楚。引种后必须进行适应性出菇试验验证。 5.3　 母种活化 母种活化配方及操作流程应符合 NY/T 528要求。活化后母种质量应符合GB 19170要求。 5.4　 摇瓶液体菌种生产 5.4.1　 容器 使用无色或近无色专用玻璃菌种甁，可用棉塞（梳棉或化纤棉）、硅胶塞、专用封口透气膜封口。 5.4.2　 培养基配方 可选用以下配方： a) 配方1：葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，酵母膏3 g，磷酸二氢钾3 g，硫酸镁1.5 g，维生素B1 5 mg，水1 L，pH 6.0～6.5； b) 配方2：玉米粉20 g，葡萄糖20 g，酵母膏5 g，牛肉膏4 g，磷酸二氢钾2 g，硫酸镁1 g，维生素B1 5 mg，水1 L，pH 6.0～6.5。 生产用水应符合GB 5749要求，培养基质应符合NY/T 528要求，玉米粉应过20目筛。 5.4.3　 培养基配制 按液体培养基配方配制，玉米粉先用水搅拌均匀，装入摇瓶中，混合均匀，装液量为摇甁容量的 2/5～3/5，瓶塞封口，并用硫酸纸或牛皮纸包扎。 5.4.4　 灭菌 将分装好的摇瓶放入灭菌锅内，锅内留有一定的空隙。检查锅内水位，立即灭菌。灭菌蒸汽压力升至0.1 MPa～0.12 MPa，恒压维持35 min～40 min。 5.4.5　 接种 待培养基冷却后于消毒过的超净工作台上，用经火焰消毒并冷却后的接种针挑取5～6块（3～5）mm×（3～5）mm的母种块迅速转接于待接种摇甁培养基内。 5.4.6　 摇瓶菌种培养 种结束后封口，放入恒温箱中23 ℃～25 ℃ 静置培养1 d，然后置于摇床上震荡培养，摇床温度控制在23 ℃～25 ℃ ，转速140 r/min～160 r/min，培养时间10 d～12 d。 5.4.7　 摇瓶菌种质量标准 培养液澄清透明，无杂菌、无异味；镜检无杂菌、菌丝形态正常；菌丝球、菌丝片段密集，不低于整个培养液80 %，均匀悬浮于液体培养基中不分层。 5.5　 发酵罐液体菌种生产 5.5.1　 煮罐、空消 发酵罐初次使用、出现杂菌、长期放置、更换品种等情况出现其一时，应煮罐和空消。蒸气压力0.15 MPa、温度126 ℃，维持40 min。 5.5.2　 液体菌种培养基配方 可选用以下配方： a) 配方1：玉米粉20 g，葡萄糖20 g，酵母膏5 g，牛肉膏4 g，磷酸二氢钾2 g，硫酸镁1g，维生素B15 mg，消泡剂0.3 g，水1 L，pH 6.0～6.5； b) 配方2：马铃薯100 g（煮汁），葡萄糖10 g，麦麸40 g（煮汁），蛋白胨2 g，磷酸二氢钾2 g，硫酸镁1 g，消泡剂0.3 g，水1 L，pH 6.0～6.5； c) 配方3：玉米粉20 g，麦麸20 g（煮汁），葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，磷酸二氢钾2 g，硫酸镁1 g，消泡剂0.3 g，水1 L，pH 6.0～6.5。 生产用水应符合GB 5749要求，培养基质应符合 NY/T 528要求，玉米粉应过20目筛。 5.5.3　 投料和定容 用水把淀粉、玉米粉等原料搅拌均匀，不能有结块，通过吸管或漏斗加入罐体，装液量为罐体容量的70 %～80 %，加入0.03 %消泡剂，通入空气搅拌1 min～2 min，混合均匀，拧紧上料口盖。 5.5.4　 灭菌 发酵罐加热层通入冷水，水位低于排水口20 cm，关闭进、排水阀门加热。待加热层蒸汽压力达到0.05 MPa时，缓慢打开排气阀降压至0 MPa，关闭排气阀，再次升压至0.11 MPa；待发酵罐培养层蒸汽压力达到0.05 MPa时，缓慢打开排气阀降压至0 MPa，关闭排气阀，再次升压至0.11 MPa，同时打开空气过滤器灭菌，微开排气阀，维持50 min～60 min。 5.5.5　 冷却 灭菌结束，关闭空气过滤器灭菌阀与排气阀，缓慢打开空气过滤器排水阀降压至0 MPa，加热层通入冷水降温；同时缓慢打开发酵罐培养层排气阀降压，待压力接近0 MPa时向培养层内通入无菌空气，调整排气阀，维持罐压0.04 MPa～0.05 MPa，培养液温度降至25 ℃以下时，关闭加热层进水阀。 5.5.6　 接种 接入摇甁菌种，接种量为2 %～4 %。将摇瓶接种管和发酵罐接种口用75 %酒精消毒，用95 %酒精的火焰圈套在接种口上，轻微打开呼吸器阀门，使发酵罐压力为0 MPa。点燃火焰圈，在火焰保护下用镊子去掉接种管上的牛皮纸和瓶塞，打开接种口阀门，将接种管插入接种口，将摇瓶菌种注入发酵罐。拔出接种管，关闭接种阀门，去掉火焰圈，打开空气压缩机。 5.5.7　 发酵罐菌种培养 根据菌丝生长情况，适时调节进气按钮，通入适量无菌空气，同时调节排气阀，维持罐压0.01 MPa～0.03 MPa，培养温度控制在23 ℃～25