DB37T 3674-2019 饲料中维生素A、维生素D3、维生素E的同步快速测定高效液相色谱法.doc

ICS 65.120 B 46       DB37 山东省地方标准 DB 37/T 3674—2019       饲料中维生素A、维生素D3、维生素E的同步快速测定　高效液相色谱法 2019 - 08 - 30发布 2019 - 09 - 30实施 山东省市场监督管理局   发布 DB37/T 3674—2019 目  次 前言 II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 原理 1 4 试剂或材料 1 5 仪器设备 2 6 样品 2 7 试验步骤 2 7.1 提取 2 7.2 浓缩 2 7.3 液相色谱参考条件 3 7.4 标准系列溶液 3 7.5 测定 3 8 试验数据处理 3 8.1 维生素A乙酸酯含量 3 8.2 维生素D3含量 4 8.3 维生素E乙酸酯含量 5 9 精密度 5 附　录　A （规范性附录） 维生素A乙酸酯、维生素D3、维生素E乙酸酯标准溶液浓度校正方法 6 附　录　B （资料性附录） 维生素A乙酸酯、维生素D3和维生素E乙酸酯标准溶液的高效液相色谱图 7 前  言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省饲料质量检验所、青岛市华测检测技术有限公司。 本标准主要起草人：强莉、吕明春、刘雪芹、李斌、宫玲玲、李俊玲。 6 饲料中维生素A、维生素D3、维生素E的同步快速测定 高效液相色谱法 1　 范围 本标准规定了饲料中维生素A乙酸酯、维生素D3、维生素E乙酸酯测定的高效液相色谱方法。 本标准适用于复合预混合饲料、维生素预混合饲料中维生素A乙酸酯、维生素D3、维生素E乙酸酯的测定。其他饲料可参照执行。 本方法定量限：维生素A乙酸酯为10 000 IU/kg；维生素D3为40 000 IU/kg；维生素E乙酸酯为100 mg/kg。 2　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1　饲料采样 GB/T 20195　动物饲料　试样的制备 3　 原理 试样中的维生素A乙酸酯、维生素D3和维生素E乙酸酯用二甲基亚砜(DMSO)超声溶解，经正己烷萃取、浓缩、复溶后，供高效液相色谱仪测定，外标法定量。 4　 试剂或材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 4.1　 水：GB/T 6682，一级。 4.2　 正己烷。 4.3　 二甲基亚砜（DMSO）：色谱纯。 4.4　 甲醇：色谱纯。 4.5　 维生素A乙酸酯标准储备溶液（1 mg/mL）：称取维生素A乙酸酯标准品（CAS：127-47-9，纯度不低于99.0 %）50 mg(准确至0.01 mg)于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇(4.4)溶解定容。置-18 ℃冰箱保存，有效期为3个月。临用前利用紫外分光光度计检测其吸光度值，计算其准确浓度。（校正方法见附录A）。 4.6　 维生素D3标准储备溶液（1 mg/mL）：称取维生素D3标准品（CAS：67-97-0，纯度不低于99.0 %）50 mg(准确至0.01 mg)于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇(4.4)溶解定容。置-18 ℃冰箱避光保存。有效期为3个月。临用前利用紫外分光光度计检测其吸光度值，计算其准确浓度。（校正方法见附录A）。 4.7　 维生素E标准工作溶液（1 mg/mL）：称取DL-а-生育酚乙酸酯标准品（CAS：7695-91-2，纯度不低于99.0 %）50 mg(准确至0.01 mg)于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇(4.4)溶解定容。置-18 ℃冰箱避光保存。有效期为3个月。临用前利用紫外分光光度计检测其吸光度值，计算其准确浓度。（校正方法见附录A）。 4.8　 维生素A标准工作液：准确吸取1.00 mL的维生素A标准储备液（4.5）于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。维生素A标准工作液浓度为100 μg/mL。于-18 ℃保存，有效期为半个月。 4.9　 维生素D3标准工作液：准确吸取0.50 mL维生素D3标准储备液（4.6）于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。维生素D3标准工作液浓度为50 μg/mL。于-18 ℃保存，有效期为半个月。 4.10　 析相分离纸：1 PS。 4.11　 微孔滤膜：0.22 µm，有机相。 5　 仪器设备 5.1　 高效液相色谱仪：配有紫外或二极管阵列检测器。 5.2　 电子天平：感量为0.1 mg和0.01 mg。 5.3　 紫外分光光度计。 5.4　 超声波振荡器。 5.5　 振荡器：频率不低于250次/min。 5.6　 旋转蒸发器。 5.7　 氮吹仪。 5.8　 平底烧瓶（具塞）：棕色500 mL。 6　 样品 按GB/T 20195制备试样，取不少于250 g样品，全部过1.0 mm孔径分析筛，筛上物不大于3 %，混合均匀后，装入密闭容器中，于2～8 ℃避光保存。 7　 试验步骤 7.1　 提取 平行做两份试验。称取试样1～3 g(准确至0.1 mg)，置于500 mL平底烧瓶中，加30 mL的DMSO（4.3），在超声波水浴中超声提取30 min（水温不宜超过35度；中间旋摇2～3次以防样品附着瓶底）；取出放置冷却。 注： 在加入DMSO的过程中，小心试样结块。先倒入少许DMSO，振摇烧瓶，将试样摇匀，再将剩余DMSO沿烧瓶壁冲洗，使附着在内壁的试样全部冲洗到烧瓶的底部。 待冷却至室温后，准确加入100 mL正己烷（4.2），加盖、剧烈振摇（频率250次/min）15 min，静置分层后再次准确加入100 mL正己烷（4.2），重复提取一次，静置；待正己烷层变澄清透明，且中间乳化层消失以后，将全部正己烷层萃取液经析相分离纸过滤，待测。 7.2　 浓缩 准确移取一定体积的滤液（依据样品标示量、称样量和提取液用量确定分取量）置于旋转蒸发器烧瓶中，在不超过40 ℃条件下缓慢真空蒸发至近干或直接用氮气吹干。残渣用甲醇（4.4）溶解，并稀释至10 mL，使获得的溶液中每毫升含维生素A为20 IU～50 IU、维生素D3为300 IU～400 IU、维生素E为200 μg～300 μg，过0.22 µm微孔滤膜，待测。 7.3　 液相色谱参考条件 色谱柱：C18，长250 mm，内径4.6 mm，粒径5 µm，或性能相当者。 柱温：30 ℃； 进样量：10 μL； 流动相：甲醇+水=97+3； 流速：1.0 mL/min； 检测波长：维生素A乙酸酯 325 nm；维生素D3 264 nm；维生素E乙酸酯 285 nm。 7.4　 标准系列溶液 7.4.1　 维生素A标准系列溶液：准确移取适量标准工作液(4.8)于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释定容配成标准系列溶液，浓度分别为：0.50 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、8.0 μg/mL、10.0μg/mL、20.0 μg/mL。现用现配。 7.4.2　 维生素D3标准系列溶液：准确移取适量标准工作液(4.9)于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释定容配成标准系列溶液，浓度分别为：0.20 μg/mL、0.50 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、8.0 μg/mL、10.0 μg/mL。现用现配。 7.4.3　 维生素E标准系列溶液：准确移取适量标准工作溶液(4.7)于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释定容配成标准系列溶液，浓度分别为：20.0 μg/mL、40.0 μg/mL、80.0 μg/mL、100.0 μg/mL、200.0 μg/mL、300.0 μg/mL、500.0 μg/mL。现用现配。 7.5　 测定 按照7.3给出的色谱参考条件，依次上机测定标准系列溶液和试样溶液。试样溶液与标准溶液中维生素A、维生素D3和维生素E的保留时间相对偏差在±2.5 %之内。在仪器线性之内范围，以维生素A、维生素D3和维生素E的浓度为横坐标，以其响应值（峰面积）为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线相关系数不低于0.99。单点校准时，试样溶液与标准溶液中待测物的响应值相差不超过30 %。如超出线性范围，应用甲醇稀释（n倍）后，重新进样分析。维生素A、维生素D3和维生素E标准溶液图谱参见附录B.1～B.3。 8　 试验数据处理 8.1　 维生素A乙酸酯含量 8.1.1　 试样中维生素A乙酸酯的含量ω1质量分数[国际单位（或毫克）每千克（IU或mg/kg）]表示，单点校准按式（1）计算： (1) 式中： m ——试样质量，单位为克（g）； V ——定容体积，单位为毫升（mL）； n1 ——稀释倍率； ρ1——维生素A乙酸酯标准工作液浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； P1 ——试样溶液峰面积值； P2 ——维生素A乙酸酯标准工作液峰面积值； f1 ——转换系数，1国际单位（IU）相当于0.344 μg维生素A乙酸酯。 8.1.2　 试样中维生素A乙酸酯的含量ω1质量分数[国际单位（或毫克）每千克（IU或mg/kg）]表示，多点校准按式（2）计算： (2) 式中： m ——试样质量，单位为克（g）； V ——定容体积，单位为毫升（mL）； n1 ——稀释倍率； c1 ——由标准曲线查得试样中待测物色谱峰面积对应的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； f1 ——转换系数，1国际单位（IU）相当于0.344 μg维生素A乙酸酯。 平行测定结果用算术平均值表示，保留三位有效数字。 8.2　 维生素D3含量 8.2.1　 试样中维生素D3含量ω2质量分数[国际单位（或毫克）每千克（IU或mg/kg）]表示，单点校准按式（3）计算： (3) 式中： m ——试样质量，单位为克（g）； V ——定容体积，单位为毫升（mL）； n2 ——稀释倍率； ρ2——维生素D3标准工作液浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； P3 ——试样溶液峰面积值； P4 ——维生素D3标准工作液峰面积值； f2 ——转换系数，1国际单位（IU）维生素D3相当于0.025 μg胆钙化醇。 8.2.2　 试样中维生素D3含量ω2质量分数[国际单位（或毫克）每千克（IU或mg/kg）]表示，多点校准按式（4）计算： (4) 式中： m ——试样质量，单位为克（g）； V ——定容体积，单位为毫升（mL）； n2 ——稀释倍率； c2 ——由标准曲线查得试样中待测物色谱峰面积对应的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； f2 ——转换系数，1国际单位（IU）维生素D3相当于0.025 μg胆钙化醇。 平行测定结果用算术平均值表示，保留三位有效数字。 8.3　 维生素E乙酸酯含量 8.3.1　 试样中维生素E乙酸酯含量ω3质量分数[国际单位（或毫克）每千克（IU或mg/kg）]表示，单点校准按式（5）计算： (5) 式中： m ——试样质量，单位为克（g）； V ——定容体积，单位为毫升（mL）； n3 ——稀释倍率； ρ3——维生素E乙酸酯标准工作液浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； P5 ——试样溶液峰面积值； P6 ——维生素E乙酸酯标准工作液峰面积值； f3 ——转换系数，转换系数，1国际单位（IU）维生素E相当于1.0 mg dl-α-生育酚乙酸酯。 8.3.2　 试样中维生素E乙酸酯含量ω3质量分数[国际单位（或毫克）每千克（IU或mg/kg）