DB37T 3234-2018 动物源食品中泰万菌素残留量的测定 液相色谱一串联质谱法.doc

ICS 67.120 B45       DB37 山东省地方标准 DB 37/T 3234—2018       动物源食品中泰万菌素残留量的测定 液相色谱—串联质谱法 Determination of tylvalosin residue in animal source food by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry 2018 - 05 - 17发布 2018 - 06 - 17实施 山东省质量技术监督局   发布 DB37/T 3234—2018 前  言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：青岛农业大学。 本标准主要起草人：郝智慧、魏秀丽、曲少奇、唐启和、翟冰、孙京新、徐坤、袁玉清、黄亭亭。 5 动物源食品中泰万菌素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1　 范围 本标准规定了动物源食品中泰万菌素药物残留量的液相色谱—串联质谱法测定法。 本标准适用于猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝等动物源食品中泰万菌素药物残留量的测定。 本标准检测限为0.4 μg/kg，定量限为1.0 μg/kg。 2　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3　 原理 采用乙腈提取试样中残留的泰万菌素，提取液采用氮气吹干重新溶解后，经混合型阴离子固相萃取小柱净化，浓缩，用液相色谱—串联质谱检测，外标法定量。 4　 试剂或材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂，水符合GB/T 6682一级水的规定。 4.1　 乙腈（CH3CN）：色谱纯。 4.2　 甲醇（CH3OH）：色谱纯。 4.3　 甲酸（HCOOH）：色谱纯。 4.4　 氨水（NH3•H2O）。 4.5　 异丙醇（C3H8O）。 4.6　 2 %甲酸水溶液：准确取甲酸（4.3）2.0 mL，加水稀释并定容至100 mL。 4.7　 10 %氨化甲醇异丙醇溶液：10 %氨化甲醇+异丙醇=1+1，准确取浓氨水（4.4）10 mL，加甲醇（4.2）90 mL稀释至100 mL，再加入100 mL异丙醇（4.5）混匀即得。 4.8　 0.1 %甲酸乙腈溶液：0.1 %甲酸+乙腈=7+3，准确量取0.1%甲酸水溶液（4.9）70 mL，加甲醇（4.2）30 mL，用水稀释至100 mL。 4.9　 0.1 %甲酸水溶液：准确移取甲酸（4.3）0.5 mL，加水稀释并定容至500 mL，过0.22 µm水系微孔滤膜脱气备用。现用现配。 4.10　 标准品：酒石酸乙酰异戊酰泰乐菌素（Acetylisovaleryltylosin Tartrate），CAS编号：63428-13-7。泰万菌素（Tylvalosin）又称为乙酰异戊酰泰乐菌素。 4.11　 泰万菌素标准储备液：准确称取酒石酸乙酰异戊酰泰乐菌素标准品约11.5 mg（精确到0.01 mg）（4.10），加乙腈（4.1）至100 mL，配制成100.0 µg/mL的溶液，作为外标储备液，-20 ℃冰箱保存。 4.12　 泰万菌素标准工作液：准确量取一定体积的泰万菌素标准储备液（4.11），用乙腈稀释成浓度为1 µg/mL的标准工作液。现配现用。 4.13　 混合型阴离子固相萃取小柱： 150 mg/6 mL,，30 µm。 4.14　 聚丙烯离心管：50 mL，15 ml具塞，带刻度。 4.15　 微孔滤膜：0.22 µm有机相过滤膜。 5　 仪器设备 5.1　 液相色谱—串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。 5.2　 天平：感量0.01 g。 5.3　 分析天平：感量0.00001 g。 5.4　 均质器（20000 r/min）。 5.5　 氮气吹干仪。 5.6　 真空泵及固相萃取装置。 5.7　 色谱柱：C18（4.6 mm×150 mm, 5 μm，或相当者）。 5.8　 高速冷冻离心机（10000 r/min）。 5.9　 涡旋振荡器。 6　 测定步骤 6.1　 试料的制备 试料的制备包括： a) 取均质后的供试样品，作为供试试样； b) 取均质后的空白样品，作为空白试样； c) 取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液，作为空白添加试样。 6.2　 试料的保存 -18 ℃以下保存。 6.3　 提取 a) 称取试样2 g（精确至0.01 g），置于50 mL聚丙烯离心管中，加入10 mL乙腈(4.1)，均质提取1 min后，5000 r/min离心5 min，取上清液至另一干净的50 mL离心管中； b) 残渣中加入10 mL乙腈重复提取一下，离心后合并上清液； c) 将提取液置于50 ℃水浴中，吹氮浓缩至干； d) 在残渣中加入1 mL甲醇(4.2)，涡旋振荡30 s，待净化。 6.4　 净化 a) 取混合型阴离子固相萃取小柱(4.3)，依次使用3 mL甲醇、3 mL水活化，保持柱体湿润； b) 将待净化溶液转移至已活化好的混合型阴离子固相萃取小柱上； c) 依次用3 mL 2 %甲酸水溶液(4.6)、3 mL甲醇清洗，用真空泵抽干小柱10 s； d) 用10 %氨化甲醇异丙醇溶液6 ml (4.7)洗脱入15 mL离心管，将提取液置于50 ℃水浴中； e) 吹氮浓缩至干，加入1 mL 0.1 %甲酸乙腈溶液（4.8），涡旋振荡30 s，过有机微孔滤膜后，液相色谱—串联质谱仪测定。 6.5　 标准曲线的制备 准确量取适量的泰万菌素标准工作液，用0.1 %甲酸乙腈溶液（4.8）稀释成浓度分别为0.5 μg/L、1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L的对照溶液，供液相色谱—串联质谱仪分析。 6.6　 测定 6.6.1　 液相色谱参考条件 6.6.1.1　 色谱柱：C18色谱柱，4.6 mm×150 mm, 5 μm, 或相当者。 6.6.1.2　 流动相A：0.1 %甲酸水溶液；流动相B：乙腈；流速：0.3 mL/min。 6.6.1.3　 进样量：5 μL。 6.6.1.4　 柱温：35 ℃。 6.6.1.5　 流动相及梯度洗脱条件见表1。 表1　 流动相及梯度洗脱条件 时间（min） 0.1%甲酸水溶液（%） 乙腈（%） 0.0 70 30 0.5 70 30 4.0 30 70 4.5 70 30 7.0 70 30 6.6.2　 质谱参考条件 6.6.2.1　 电离模式：电喷雾正离子（ESI+） a) 毛细管电压：3 v；离子源温度：110 ℃； b) 脱溶剂温度：320 ℃； c) 脱溶剂氮气流速：550 L/h； d) 监测方式：多反应监测（MRM）。 6.6.2.2　 泰万菌素的特征离子对、碰撞能量和锥孔电压见表2。 表2　 泰万菌素的特征离子对、碰撞能量和锥孔电压 序号 化合物 母离子 子离子 锥孔电压/V 碰撞能量/eV 1 泰万菌素 1042.5 109.6 30 45 6.6.3　 定性测定 6.6.3.1　 通过试样色谱图的保留时间与相应标准品的保留时间、各色谱峰的特征离子与相应浓度标准溶液各色谱峰的特征离子相对照定性。 6.6.3.2　 试样与对照品保留时间的相对偏差在±2.5 %之内；试样特征离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表3的规定，则可判断试样中存在泰万菌素残留。 表3　 定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度,% ＞50 ＞20 至 50 ＞10 至 20 ≤10 允许的相对偏差,% ±20 ±25 ±30 ±50 6.6.4　 定量测定 6.6.4.1　 对基质标准工作溶液进样，以峰面积为纵坐标、基质标准工作溶液浓度为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中泰万菌素的响应值应在仪器测定的线性范围内。 6.6.4.2　 泰万菌素标准溶液的多反应监测（MRM）色谱图参见附录A中的图A.1。 7　 结果计算 供试试样中泰万菌素残留量X，单位为ng/g，按式(1)计算： (1) 式中： A1－试样溶液中泰万菌素峰面积； A2－标准溶液中泰万菌素峰面积； C－标准溶液中泰万菌素浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)； V－溶解残渣的初始流动相体积，单位为毫升(mL)； m－试样质量，单位为克(g)。 注1： 测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。 8　 检测方法的灵敏度、准确度和精密度 8.1　 灵敏度 本方法泰万菌素检出限为0.4 μg/kg，定量限为1 μg/kg。 8.2　 准确度 本方法泰万菌素在0.5 μg/kg、1 μg/kg、10 μg/kg添加水平的回收率为90 %～110 %。 8.3　 精密度 本方法批内相对标准偏差≤8 %，批间相对标准偏差≤8 % 。 A A 附　录　A （资料性附录） 泰万菌素标准溶液的MRM色谱图 图A.1　 泰万菌素标准溶液（10 µg/L）的多反映监测(MRM)色谱图 _________________________________