DB37T 3571-2019 牛副结核病γ干扰素ELISA诊断技术.doc

ICS 11.220 B 41       DB37 山东省地方标准 DB 37/T 3571—2019       牛副结核病γ干扰素ELISA诊断技术 Diagnosis on bovine paratuberculosis by enzyme-linked immunoassay of γ-interferon 2019 - 05 - 29发布 2019 - 06 - 29实施 山东省市场监督管理局   发布 DB37/T 3571—2019 目  次 前言 II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 试验原理 1 5 试剂及仪器 1 5.1 材料 1 5.2 仪器 2 6 检测方法 2 6.1 试剂配制 2 6.2 采血 2 6.3 全血培养 2 6.4 检测步骤 2 7 结果判定 2 7.1 样品结果计算 2 7.2 阴阳性结果判定标准 3 8 废弃物的处理 3 9 检测过程中防止交叉污染的措施 3 10 操作注意事项 3 附　录　A （资料性附录） 血液处理所需材料 4 附　录　B （资料性附录） ELISA试验所需试剂 5 附　录　C （资料性附录） 检测所需仪器 6 附　录　D （规范性附录） 检测所用试剂的配制 7 前  言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心。 本标准主要起草人：解晓莉、杨宏军、张亮、孙阳阳、程凯慧、楚会萌、刘来兴、杨美。 8 牛副结核病γ干扰素ELISA诊断技术 1　 范围 本标准规定了牛副结核病γ干扰素ELISA诊断技术的术语和定义、试剂及仪器、检测方法、结果判定和操作注意事项等。 本标准所规定的技术适用于牛感染副结核分枝杆菌时γ干扰素的检测。 2　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489—2008　实验室生物安全通用要求 GB/T 19495.2—2004　转基因产品检测　实验室技术要求 SN/T 1084—2010　牛副结核病检疫技术规范 3　 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1　 牛副结核病　Paratuberculosis 一种由副结核分枝杆菌（禽分枝杆菌副结核亚种）引起的以慢性增生性、顽固性肠炎和进行性消瘦为特征的慢性传染病，具有强烈的传染性，可垂直传播。 4　 试验原理 被副结核分枝杆菌致敏的T淋巴细胞再次受到相关抗原刺激后可短时间内释放大量的γ干扰素（γ-Interferon），通过γ干扰素的检测可实现对副结核分枝杆菌感染的诊断。 5　 试剂及仪器 5.1　 材料 5.1.1　 血液处理所需材料 血液培养所需材料参见附录A。 5.1.2　 ELISA试验所需试剂 ELISA试验所需试剂参见附录B。 5.2　 仪器 检测所需仪器参见附录C。 6　 检测方法 6.1　 试剂配制 检测所需试剂及制备方法按附录D的规定。 6.2　 采血 血液的采集按SN/T 1084—2010规定的方法执行。将采集的血液(至少5 mL)放入肝素抗凝管中，轻轻颠倒6～10次混合血液，使肝素溶解，室温(22 ℃±5 ℃)下运送到实验室并在采血后30 h内进行培养。 6.3　 全血培养 6.3.1　 血液分装 用一次性自动移液器在无菌条件下将抗凝血加入24孔组织培养板，每份血分三孔，1.5 mL/孔。 6.3.2　 加入抗原 6.3.2.1　 无菌操作下分别加入100 μL PBS(阴性抗原对照)，禽结核提纯菌素（A-PPD）及牛结核提纯菌素（B-PPD）至相应的孔。 6.3.2.2　 用微量振荡器高速振荡1 min，将抗原与分装的血液充分混匀。或将细胞培养板及其盖紧紧固定在一起，在光滑的表面上顺时针和逆时针各旋转10次。 6.3.3　 孵育 将组织培养板在37 ℃恒温培养箱中孵育16 h～24 h。 6.3.4　 血浆样品收取及贮存 用可调移液器小心吸取约400 μL的上层血浆，转入新的1.5 mL离心管中。吸取血浆时应尽量避免吸入细胞。将盖子密封，表明时间、编号等信息，在2 ℃～8 ℃可贮存7天，在-20 ℃可贮存数月。检测前，样品应恢复至室温并充分混匀。 6.4　 检测步骤 6.4.1　 溶解冻干试剂，按“说明10”平衡其他试剂。 6.4.2　 按照商品化牛IFN-γ检测试剂盒说明书进行牛IFN-γ的ELISA检测。 6.4.3　 质量控制。按照试剂盒质量控制标准判断试验的有效性。如果试验中阴阳性对照结果有一条不符合试验标准，试验则视为无效，应重新检测。 7　 结果判定 7.1　 样品结果计算 计算每个样品阴性抗原、A-PPD和B-PPD的平均OD值。 7.2　 阴阳性结果判定标准 A-PPD与PBS OD值的差值≥0.35，且与B-PPD OD值的差值≥0.25时，判为阳性； A-PPD与PBS OD值的差值＜0.35，或与B-PPD OD值的差值＜0.25时，判为阴性。 8　 废弃物的处理 按照GB 19489—2008的规定执行。 9　 检测过程中防止交叉污染的措施 按照GB/T19495.2—2004的规定执行。 10　 操作注意事项 10.1　 除100倍浓缩的结合物外，所有待检血浆和试剂在使用前应恢复至室温(22 ℃±5 ℃)。解冻的样品需小心涡旋，充分混和。加热的温度不应超过37 ℃。室温水浴箱可缩短平衡时间。 10.2　 试剂盒内所有试剂均应储存于2 ℃～8 ℃，使用完后即放回2 ℃～8 ℃低温冰箱中。放于室温(22 ℃±5 ℃)的工作浓度的洗液应两周内用完。 10.3　 100倍浓缩的结合物和稀释后的结合物应放置在2 ℃～8 ℃低温冰箱中。 10.4　 为保证试验效果，应使冻干试剂完全溶解，溶解后的试剂至少需放置15 min，然后轻轻颠倒混合4～5次；也可以使用滚动振荡装置混合。使用前需再次混匀。 10.5　 采用去离子水或双蒸水溶解或稀释试剂。 A A 附　录　A （资料性附录） 血液处理所需材料 肝素真空管 10 mL或20 mL注射器 无菌的24孔组织培养板 100～1 000 μL吸头 1.5 mL离心管 Bovigam牛型提纯结核菌素(B-PPD)，300头动物1支 Bovigam禽型提纯结核菌素(A-PPD)，300头动物1支 无菌的磷酸盐缓冲液（0.01M pH7.2） B B 附　录　B （资料性附录） ELISA试验所需试剂 酶标板(包被IFN-γ抗体) 牛γ干扰素阳性对照(含0.01 %的硫柳汞) 牛γ干扰素阴性对照(含0.01 %的硫柳汞) 样品稀释液(血浆稀释缓冲液，含0.01 %硫柳汞） 20倍洗液(含0.01 %的硫柳汞) 100倍酶标结合物(含0.01 %的硫柳汞) 酶标抗体稀释液(酶标结合物稀释缓冲液，含0.0l %的硫柳汞） 底物缓冲液(含H2O2) 100倍浓缩的显色剂溶液(含溶于DMSO的TMB） 终止液(0.5 M H2SO4) C C 附　录　C （资料性附录） 检测所需仪器 37 ℃培养箱 精密可调移液器（200 μL、1 mL） 1 mL、5 mL、10 mL的移液器 100 mL、1 L、2 L的量筒 12道移液器(50 μL-300 μL) 微量振荡器 洗板机 酶标仪(含450 nm和650 nm滤光片) D D 附　录　D （规范性附录） 检测所用试剂的配制 D.1　 抗原 牛型提纯结核菌素和禽型提纯结核菌素在使用前彻底混匀，独立分装(0.3 mg/mL）。 D.2　 酶标板 酶标板在未开封前恢复至室温，可放置30 min以上。 D.3　 阳性对照和阴性对照 用1 mL去离子水或蒸馏水溶解阴、阳性对照。应保证完全溶解，溶解的阴阳性对照在3个月内可储存于2 ℃～8 ℃，但再次使用前应恢复至室温并充分混匀。 D.4　 样品稀释液 恢复至室温并充分混匀，用作血浆稀释缓冲液。 D.5　 酶标结合物 用0.5 mL去离子水或蒸馏水溶解100倍浓缩的冻干酶标结合物。100倍浓缩的酶标结合物必须一直保存于2 ℃～8 ℃，溶解后的酶标结合物应在3个月内用完。酶标抗体稀释液可直接使用。按表D.1配制酶标结合物工作液，配制完后应在5 min内使用，未用完的试剂应立即丢弃。未用完的100倍浓缩的酶标结合物应立即放回至2 ℃～8 ℃条件下保存。 表D.1　 酶标结合物配制表 酶标板数量 浓缩酶标结合物(100倍)的体积 酶标抗体稀释液的体积 1 0.12 mL 12 mL 2 0.24 mL 24 mL D.6　 洗液 配制工作浓度的洗液，将19份去离子水或蒸馏水加入1份20倍浓缩的洗液中，充分混匀。工作浓度的洗液可在室温贮存2周，未用完的20倍浓缩洗液应放回至2 ℃～8 ℃条件下保存。20倍浓缩洗液可能含有结晶盐，如出现结晶，应于37 ℃重新溶解结晶。 D.7　 底物溶液 将底物缓冲液和100倍显色剂溶液恢复至室温，稀释前充分混匀。底物溶液的配制见表D.2。底物溶液应充分混匀且应当是无色的，如出现蓝色应丢弃。配制完后应在10 min内使用。 表D.2　 底物配制表 酶标板数量 浓缩显色剂(100倍)的体积 底物缓冲液的体积 1 0.12 mL 12 mL 2 0.24 mL 24 mL