DB37T 3573-2019 牛支原体诊断技术规程.doc

ICS 11.220 B 41       DB37 山东省地方标准 DB 37/T 3573—2019       牛支原体诊断技术规程 Code of Practice for the Diagnosis of Mycoplasma Bovis 2019 - 05 - 29发布 2019 - 06 - 29实施 山东省市场监督管理局   发布 DB37/T 3573—2019 目  次 前言 II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语与定义 1 4 试剂及仪器 1 4.1 试剂 1 4.2 仪器 2 5 样品采集与处理 2 5.1 疑似牛支原体感牛只的判断 2 5.2 疑似病例样品的采集 2 5.3 样品处理 2 6 微生物学检测法 2 6.1 液体培养 2 6.2 菌落形态观察 2 6.3 Dienes染色 3 6.4 生化试验 3 6.5 结果判定 3 7 核酸检测法 3 7.1 DNA模板的制备 3 7.2 PCR检测 3 7.3 凝胶电泳 4 7.4 质量控制 4 7.5 结果判定 4 8 废弃物的处理和检测过程中安全措施 4 9 操作注意事项 5 附　录　A （规范性附录） 培养基的制备方法 6 前  言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。 本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、中国农业科学院兰州兽医研究所、威海市畜牧兽医局。 本标准主要起草人：张亮、杨宏军、解晓莉、孙阳阳、储岳峰、赵国清、程凯慧、楚会萌、刘来兴、杨美。 6 牛支原体诊断技术规程 1　 范围 本标准规定了牛支原体诊断技术的术语和定义、试剂及仪器、样品的采集与处理方法、生化鉴定方法、核酸检测方法和操作注意事项等。 本标准适用于牛支原体的实验室诊断。 2　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 6682—2008　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14926.8—2001　实验动物　支原体检测方法 GB 15981—1995　消毒与灭菌效果的评价方法与标准 GB 19489—2008　实验室生物安全通用要求 3　 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1　 牛支原体　Mycoplasma bovis 柔膜菌纲支原体目支原体科支原体属，可引起成母牛乳腺炎、犊牛肺炎和关节炎等多种疾病的病原之一。 3.2　 Dienes　染色液 一种经典的利用天青美蓝染色检测支原体的染色液。 3.3　 类胸膜肺炎微生物培养基　Pleuropneumonia-Like Organisms medium，PPLO培养基 该培养基主要成分为牛心汤、酵母浸出物、牛肉膏等，不含精氨酸、酚红、葡萄糖等成分，主要用于多种支原体的分离和培养。 4　 试剂及仪器 4.1　 试剂 去离子水（符合GB 6682—2008的相应要求）；牛支原体检测培养基所需试剂及配制方法见附录A；Taq DNA聚合酶及其反应缓冲液；生理盐水；Dienes染色液；TAE电泳缓冲液；琼脂糖 4.2　 仪器 接种环、酒精灯、移液器（5～100 μL和100～1 000 μL）、枪头（200 μL和1 mL）、培养试管（15 mL）和玻璃平皿（90 mm）、CO2恒温培养箱、移液器、1 L容量瓶、核酸扩增仪、电泳仪、高压灭菌锅、正置光学显微镜。 5　 样品采集与处理 5.1　 疑似牛支原体感牛只的判断 5.1.1　 肺炎型，主要表现为咳嗽、喘，有清亮或脓性鼻液，伴随出现关节炎或角膜结膜炎；不同病死牛只的病变差异较大，通常病牛心叶及部分膈叶的局部红色肉变，或同时有化脓灶散在分布。 5.1.2　 乳腺炎型，主要表现为临床型乳腺炎和隐性乳腺炎，前者乳汁带血或呈灰色，后者体细胞数较高，无明显临床症状，但多数情况下单纯感染无明显的红肿热痛。 5.1.3　 关节炎型，主要表现为犊牛膝关节肿大、跛行，关节炎淡黄色或浓稠，常与肺炎性伴随发生。 5.2　 疑似病例样品的采集 根据“5.1”所述牛支原体感染的三种临床表现型，分别进行样品的采集，具体要求如下： a) 肺炎型：应采集新病死牛只的肺部实变部分或病牛的鼻腔液，置专用采样器或无菌容器中； b) 乳腺炎型：采集前，应弃病牛的前三把奶，再采集病牛乳汁约15 mL，置注射器或无菌容器中； c) 关节炎型：对采集部位进行消毒后穿刺吸取关节液约2 mL～5 mL，置注射器或无菌容器中。 5.3　 样品处理 5.3.1　 组织样品的处理 剪至云雾状后，用2 mL生理盐水重悬，7 500g离心5 min，用注射器吸取1 mL上清液经0.45 μm滤膜滤过后备用。 5.3.2　 鼻拭子的处理 用2 mL生理盐水浸润拭子后，7 500 g离心5 min，吸取1 mL上清液经0.45 μm滤膜滤过后备用。 5.3.3　 奶样或关节液样品的处理 分别取1 mL原液与1 mL生理盐水充分混合，7 500 g离心5 min，用注射器吸取1 mL上清液经0.45 μm滤膜滤过后备用。 6　 微生物学检测法 6.1　 液体培养 将0.5 mL“5.3”所述处理所得上清液加入到含4.5 mL PPLO液体培养基的试管中，置于37 ℃，5 % CO2培养箱中培养3天，选择PPLO液体培养基由红色变为黄色且透亮的培养液用于进一步检验。 6.2　 菌落形态观察 取50 μL疑似液体培养阳性的样品加入到PPLO固体培养基（配方见附录A）上，涂布均匀后，置于37 ℃，5 % CO2培养箱中培养3～5天后，4倍物镜下观察菌落形态。 6.3　 Dienes染色 将有可疑菌落的固体培养基平皿进行Dienes染色，37 ℃孵育30 min后，观察菌落颜色。 6.4　 生化试验 6.4.1　 洋地黄皂苷敏感试验 将“6.1”中变为黄色的培养液，1:10接种于含0.2 mg/mL洋地黄皂苷的PPLO液体培养中，置于37 ℃，5 % CO2培养箱中培养3天，观察培养基颜色变化。当培养基颜色不变时，说明洋地黄皂苷敏感；当培养基颜色变黄时，说明洋地黄皂苷不敏感。 6.4.2　 葡萄糖发酵试验 葡萄糖发酵试验培养基配制方法见“附录A”。将“6.1”中变为黄色的培养液，1:10接种于葡萄糖发酵试验培养基中，置于37 ℃，5 % CO2培养箱中培养3天，观察培养基颜色变化。当培养基颜色不变时，说明不发酵葡萄糖；当培养基颜色变黄时，说明发酵葡萄糖。 6.4.3　 精氨酸水解试验 精氨酸水解试验培养基配制方法见“附录A”。将“6.1”中变为黄色的培养液，1:10接种于精氨酸水解试验培养基中，置于37 ℃，5 % CO2培养箱中培养3天，观察培养基颜色变化。当培养基颜色不变或变黄时，说明不水解精氨酸；当培养基颜色变红时，说明水解精氨酸。 6.5　 结果判定 当同时满足以下条件时，判定为牛支原体阳性： a) 镜检存在圆形、中间有颗粒或隆起的煎蛋样菌落； b) Dienes染色菌落为蓝色； c) 生化鉴定结果为洋地黄敏感、不能发酵葡萄糖、不能水解精氨酸。 其他情况均视为牛支原体阴性。 7　 核酸检测法 7.1　 DNA模板的制备 7.1.1　 水煮法 取“5.3”所述的上清样1 mL于灭菌的2 mL Eppendorf管中，12 000g离心12 min，弃上清，沉淀重悬于200 μL无菌ddH20中，沸水浴15 min后立即冰浴2 min，待Eppendorf管冷却后12 000g离心10 min，取上清液即为样品DNA模板。 7.1.2　 试剂盒法 提取样品DNA模板时，采用商品化的支原体基因组DNA提取试剂盒或革兰氏阴性菌基因组DNA提取试剂盒进行提取，操作步骤参照商品化试剂盒说明书。 7.2　 PCR检测 7.2.1　 PCR反应引物 参照国际上常用的PCR诊断方法，选择针对牛支原体设计的一对特异性引物用于PCR检测（Subramaniam, et al. Molecular & Cellular Probes, 1998.），目标产物大小为1 626 bp，引物信息如下： MBOUVRC2-L：5’- TTACGCAAGAGAATGCTTCA -3’ MBOUVRC2-R：5’- TAGGAAAGCACCCTATTGAT -3’ 7.2.2　 PCR反应体系 经“7.1”提取的样品DNA模板，以牛支原体DNA作为阳性对照，ddH2O为阴性对照。PCR反应体系如表1。 表1　 牛支原体PCR反应体系中各成分添加量 试剂名称 用量 Taq 酶（1 000 U/mL） 1 μL 10×反应缓冲液（含镁离子） 2 μL dNTP（10 mM） 1 μL 上游引物（10 μM） 1 μL 下游引物（10 μM） 1 μL 检测模板 5 μL ddH20 9 μL 总体积 20 μL 7.2.3　 PCR反应条件 95 ℃预变性5 min；循环设置为95 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，设置36个循环；72 ℃充分延伸10 min；降温至4 ℃后取出产物待检。 7.3　 凝胶电泳 采用1.5 %琼脂糖凝胶，在120 V电压下，电泳35 min后，通过凝胶成像系统观察样品孔是否存在大约1 600 bp左右的亮带。 7.4　 质量控制 若阳性对照存在1 600 bp左右的亮带，且阴性对照无此亮带，即阴阳性对照成立，可进行结果判定；反之，则应重复PCR检测试验。 7.5　 结果判定 电泳结果存在1 600 bp左右亮带，所对应样品被判定为牛支原体阳性；其他情况均可被判定为牛支原体阴性。 8　 废弃物的处理和检测过程中安全措施 按照GB 19489—2008中规定执行。 9　 操作注意事项 9.1　 牛支原体的分离培养与检测应在独立试验空间进行，严格进行无菌操作，以避免交叉污染。 9.2　 采集样本应避免冷冻或高温，冷藏条件下48 h内送实验室进行检测。 9.3　 支原体培养基的配置应选用去离子水。 9.4　 从高度疑似样品中分离培养支原体时，如液体培养无变色，应继续盲传2～3代。 9.5　 培养、PCR和染色检测，均应设置阴性对照和阳性对照。 A A 附　录　A （规范性附录） 培养基的制备方法 A.1　 PPLO液体培养基（pH值为7.6） PPLO粉21.0 g，酵母粉2.5 g，葡萄糖2.5 g，丙酮酸钠2.0 g，溶于850 mL ddH2O中，加入1 % (w/v) 酚红溶液4 mL，116 ℃灭菌20 min（按照GB 15981—1995执行），加入56 ℃灭活的马血清150 mL和20万单位青霉素，调节pH值为7.6，每4.5 mL分装至15 mL培养管，冷藏保存1个月。 A.2　 PPLO固体培养基（pH值为7.6） PPLO粉21.0 g，酵母粉2.5 g，葡萄糖2.5 g，丙酮酸钠2.0 g，琼脂粉20.0 g，溶于850 mL ddH2O中，加入1 % (w/v) 酚红溶液4 mL，116 ℃灭菌20 min（按照GB 15981—1995执行），冷却至55 ℃左右。无菌操作加入56 ℃灭活的马血清150 mL和20万单位青霉素，调节pH值为7.6，每15 mL倒入90 mm无菌培养皿，冷却凝固，室温保存1周，冷藏保存1个月。 A.3　 葡萄糖发酵试验培养基