DB37T 3405-2018 动物微生物饲料添加剂中植物乳杆菌的检测.doc

ICS 65.120 B 04       DB37 山东省地方标准 DB 37/T 3405—2018       动物微生物饲料添加剂中植物乳杆菌的检测 Method for determination of Lactobacillus plantarum in animal microbial feed additives 2018 - 08 - 17发布 2018 - 09 - 17实施 山东省质量技术监督局   发布 DB37/T 3405—2018 前  言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。 本标准由主要起草单位：山东农业大学、山东戴尔塔生物工程有限公司、济宁滨阳生物科技股份有限公司、泰安市高新区同心共筑生物科技有限公司、济宁市任城区畜牧兽医局、泰安市新众发生物技术有限公司、泰安市圣达富生物技术推广中心、南京福海生物科技有限公司、南京根洋生物科技有限公司、泰安智博生物科技有限公司。 本标准主要起草人：王雪鹏、闫硕、常维山、戴培强、孙杰、张洪喜、王焕高、李福昌、刘建柱、马洪超。 9 动物微生物饲料添加剂中植物乳杆菌的检测 1　 范围 本标准规定了饲用微生物添加剂中植物乳杆菌的检验方法。 本标准适用于饲用微生物添加剂和饲料中植物乳杆菌的检测。 2　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 14699.1 饲料 采样 GB/T 20195 动物饲料 试样的制备 GB/T 8170-2008 数值修约规则与极限数值的表示和判定 3　 术语和定义 下列术语及定义适用于本标准。 3.1　 植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum） 是乳酸菌的一种，厌氧或兼性厌氧。菌体为直或弯的杆状，革兰氏阳性菌。单个、有时成对或成链状排列，最适生长pH 6.2，属于同型发酵乳酸菌。 4　 试剂及仪器 4.1　 试剂 4.1.1　 MRS碳酸钙培养基：见附录中A.1。 4.1.2　 厌氧包：商品化厌氧包，根据培养罐容积和厌氧包说明确定用量。 4.1.3　 山梨醇发酵管：见附录中A.2。 4.1.4　 棉子糖发酵管：见附录中A.2。 4.1.5　 甘露醇发酵管：见附录中A.2。 4.1.6　 蔗糖发酵管：见附录中A.2。 4.1.7　 水杨苷发酵管：见附录中A.2。 4.1.8　 纤维二糖发酵管：见附录中A.2。 4.1.9　 七叶苷发酵管：见附录中A.3。 4.1.10　 革兰氏染色液：见附录中A.4。 4.1.11　 硝酸盐培养基、硝酸盐试剂: 见附录中A.5。 4.1.12　 明胶培养基：见附录中A.6。 4.1.13　 过氧化氢酶检验：见附录中A.7。 4.2　 仪器 4.2.1　 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 4.2.2　 普通冰箱：0 ℃～4 ℃。 4.2.3　 恒温水浴锅：46 ℃±l ℃。 4.2.4　 电炉：温度为可调式。 4.2.5　 吸量管：容量分别为1 mL、10 mL、25 mL。 4.2.6　 广口瓶或三角瓶：容量为500 mL。 4.2.7　 培养皿：直径为90 mm。 4.2.8　 试管：18 mm×180 mm。 4.2.9　 光学显微镜：10×100倍。 4.2.10　 高压灭菌锅：使用温度为121 ℃。 4.2.11　 烘干箱：使用温度为160 ℃。 4.2.12　 厌氧培养罐：2 L～10 L。 4.2.13　 玻璃珠：直径为4 mm～5 mm。 4.2.14　 振荡箱：可调式，振荡频率为0 rpm～200 rpm 。 5　 样品准备 5.1　 样品的采集 所采样品真实、具有代表性。采样工具，如铲子、匙、采样器、试管、广口瓶、剪子等，灭菌后使用。采样数量和方法按照 GB/T 14699.1 执行。 5.2　 试样的制备 按照 GB/T 20195 进行试样的制备。 6　 操作步骤 6.1　 样品稀释 准确称取样品 25.0 g ，加入含有 50 个玻璃珠和 225 mL 生理盐水的 500 mL 灭菌三角瓶中。200 rpm 振荡箱振荡处理 0.5 h～1 h ，即得 1:10 初始稀释液。吸取初始稀释液 1 mL 于含 9 mL 无菌生理盐水试管中，即得 1:100 稀释液。根据样品含菌量，做进一步的十倍系列递增稀释。 6.2　 样品接种 选取 3 个适宜的稀释度，吸取 1 mL 6.1 所述稀释液于灭菌培养皿内。每个稀释度移种2个培养皿。注入已预冷至 50 ℃ 的MRS碳酸钙培养基 15 mL 左右，混匀。 6.3　 培养 植物乳杆菌计数培养基凝固后，翻转培养皿，置于厌氧培养罐中，放入厌氧包，密封后放入 36 ℃±1 ℃ 恒温培养箱内，36 ℃ 培养 48 h～72 h。 6.4　 菌落计数 观察菌落形态，选择菌落数30～300的培养皿，计数带有溶钙环的典型菌落。 7　 确证试验 7.1　 菌落特征 将典型单个菌落在MRS碳酸钙培养基上划线分离，厌氧培养24 h～72 h，观察菌落形态。 7.2　 菌体形态 每个培养皿挑取至少 1 个典型的菌落进行革兰氏染色、镜检。革兰氏染色方法见附录A.4。 7.3　 生理生化确证试验 挑取典型菌落分别接种麦芽糖、甘露醇、山梨醇、棉子糖、蔗糖、七叶苷、水杨苷、纤维二糖的生化反应管，并进行过氧化氢酶、硝酸盐还原、液化明胶试验。 7.4　 确证结果 7.4.1　 菌落形态 菌落为乳白色，圆形，不透明，菌落直径 1 mm～3 mm 。菌落周围培养基有透明环，透明环直径 1 mm～3 mm 。 7.4.2　 菌体形态 植物乳杆菌应为革兰氏阳性、单个存在的丝状杆菌，无芽孢。 7.4.3　 糖发酵试验 植物乳杆菌的碳水化合物发酵试验结果见表1 。 表1　 植物乳杆菌的碳水化合物发酵试验结果 麦芽糖 甘露醇 山梨醇 棉子糖 蔗糖 七叶苷 水杨苷 纤维二糖 + + + + + + + + 注： + 表示90%以上菌株为阳性。 7.4.4　 其他生理生化试验结果 过氧化氢酶阴性、硝酸盐还原阴性、液化明胶阴性。 8　 结果计算及表述 菌落计数后，随机挑取5个菌落进行鉴定（见第7章），计数证实为植物乳杆菌的菌落数，计算出该皿内的植物乳杆菌的活菌数，然后乘以稀释倍数即得每克或每毫升样品中植物乳杆菌的活菌数，按式（1）计算： (1) 式中： A——测定的植物乳杆菌菌落数，单位为菌落形成单位每克（CFU／g）或菌落形成单位每毫升（CFU／mL）； B——植物乳杆菌菌落总数 ； C——5个鉴定的菌落中确认为植物乳杆菌的菌落数； f——稀释倍数 。 注1： 按照 GB/T 8170-2008 数值修约规则计算出的结果保留至两位有效数字，也可以将样品中植物乳杆菌的菌落数记录为1.0～9.9乘以10的指数幂表示。 注2： 报告每克或每毫升样品的植物乳杆菌估计数，单位为CFU/g 或 CFU/mL 。 A A 附　录　A （资料性附录） 试剂 A.1　 MRS碳酸钙培养基 A.1.1　 成分 见表A.1。 表A.1　 MRS碳酸钙培养基成分 成分 规格 蛋白胨 10.0 g 牛肉粉 5.0 g 酵母粉 4.0 g 葡萄糖 20.0 g 吐温80 1.0 mL K2HPO4·7H2O 2.0 g CH2COONa·3H2O 5.0 g 柠檬酸三铵 2.0 g MgSO4·7H2O 0.2 g MnSO4·4H2O 0.05 g 琼脂粉 20.0 g 碳酸钙 20.0 g pH 6.2 A.1.2　 制法 将上述成分加入到 1000 mL 蒸馏水中，加热溶解，调节pH，分装后 121 ℃ 高压灭菌 15 min～20 min 。 A.2　 植物乳杆菌糖发酵管 A.2.1　 基础成分 见表A.2。 表A.2　 植物乳杆菌糖发酵管基础成分 成分 规格 牛肉膏 5.0 g 蛋白胨 5.0 g 酵母浸膏 5.0 g 吐温80 0.5 mL 表A.2 （续） 成分 规格 琼脂 1.5 g 1.6 % 溴甲酚紫酒精溶液 1.4 mL 蒸馏水 1000 mL A.2.2　 制法 按 0.5 % 加入所需糖类，并分装小试管，121 ℃ 高压灭菌 15 min～20 min 。 A.3　 七叶苷发酵管 A.3.1　 成分 见表A.3。 表A.3　 七叶苷发酵管成分 成分 规格 蛋白胨 5.0 g 磷酸氢二钾 1.0 g 七叶苷 3.0 g 柠檬酸铁 0.5 g 1.6 %溴甲酚紫酒精溶液 1.4 mL 蒸馏水 100 mL A.3.2　 制法 将上述成分加入蒸馏水中，加热溶解，121 ℃高压灭菌 15 min～20 min 。 A.4　 革兰氏染色液 A.4.1　 结晶紫染色液 A.4.1.1　 成分 见表A.4。 表A.4　 结晶紫染色液成分 成分 规格 结晶紫 1.0 g 95 ％乙醇 20 mL 1 ％草酸铵水溶液 80 mL A.4.1.2　 制法 将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。 A.4.2　 革兰氏碘液 A.4.2.1　 成分 见表A.5。 表A.5　 革兰氏碘液成分 成分 规格 碘 1.0 g 碘化钾 2.0 g 蒸馏水 300 mL A.4.2.2　 制法 将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至 300 mL 。 A.4.3　 沙黄复染液 A.4.3.1　 成分 见表A.6。 表A.6　 沙黄复染液成分 成分 规格 沙黄 0.25 g 95 %乙醇 10 mL 蒸馏水 90 mL A.4.3.2　 制法 将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。 A.4.4　 染色法 A.4.4.1　 将涂片在酒精灯火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染 1 min ，水洗。 A.4.4.2　 滴加革兰氏碘液，作用 1 min ，水洗。 A.4.4.3　 滴加 95 % 乙醇脱色，约 15 s～30 s ，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。 A.4.4.4　 滴加复染液，复染1 min。水洗、待干、镜检。 A.5　 硝酸盐还原 A.5.1　 培养基 A.5.1.1　 成分 见表A.7 。 表A.7　 培养基成分 成分 规格 蛋白胨 20.0 g 牛肉膏 3.0 g 氯化钠 5.0 g 氯化钾 1.0 g 蒸馏水 1000 mL A.5.1.2　 制法 溶解各成分于水中，必要时加热。调整PH值，使培养基pH值在 25 ℃ 时为 7.4±0.2 。分装试管，121 ℃ 高压灭菌 20 min～30 min 。 A.5.2　 试剂 见表A.8 。 表A.8　 试剂成分 成分 规格 甲液 对氨基苯磺酸 0.5 g 10%乙酸溶液 150 mL 乙液 甲萘胺 0.1 g 蒸馏水 20 mL 10%乙酸溶液 150 mL 二苯胺试剂 二苯胺 0.5 g 蒸馏水 20 mL 浓硫酸 100 mL A.5.3　 试验方法 接种菌于上述培养基中，36 ℃±1 ℃培养 2 d～4 d。加入甲液和乙液各1滴，观察结果。如溶液变为红色、橙色、棕色为硝酸盐还原阳性。如无红色出现，