SNT 2871-2011 猪萎缩性鼻炎检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2871一2011猪萎缩性鼻炎检疫技术规范Quarantine protocol for swine atrophic rhinitis2011-05-31发布2011-12-01实施中华人民共。和国国家质量监督检验检疫总局发布SN/T2871-2011前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准修改采用OIE陆生动物诊断试验和疫苗标准手册(2009版)(Manual of diagnostic testsand vaccines for terrestrial animals)第2.8.2章制定。主要修改如下：一本标准完全采用了OIE规定的病原分离、鉴定方法；一本标准增加了病原的生化鉴定的具体指标：一本标准删除了OE中提到但没有具体步骤的核酸鉴定方法和血清学方法。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局，中华人民共和国南京出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国烟台出人境检验检疫局、中华人民共和国夏门出人境检验检疫局。本标准主要起草人：姜焱、吴晓薇、侯玉峰、方绍庆、刘骏、王凯民、彭小莉、蒋鲁岩、唐泰山、张常印。SN/T2871-2011猪萎缩性鼻炎检疫技术规范1范围本标准规定了猪萎缩性鼻炎的病原的临床诊断、分离鉴定、毒素鉴定，可用于该病的检疫、诊断和流行病学调查。本标准适用于猪萎缩性鼻炎的检疫2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是往日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和式验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。AR(swine at rophic rhinitis):猪萎缩性鼻炎Bb(Bordetella bronchise ptica):支气管败血波氏杆菌NPAR(non-progressing atrophie rhinitis):非进行性菱缩性鼻炎PAR(progressive atrophic rhinitis):进行性菱缩性鼻炎Pm-A:A型荚膜的多杀性巴氏杆菌Pm-D:D型荚膜的多杀性巴氏杆菌T+Pm(toxigenic Pasteurella):产毒素多杀性巴氏杆菌4AR的检疫方法4.1AR临床诊断4.1.1AR的相关资料参见附录A。对仔猪群应检查下列症状：有一定数目的仔猪流鼻液、流泪、鼻塞或咳嗽，但无热，个别鼻液混有血液。一些仔猪发育迟滞、犬齿部位的上唇侧方肿胀。4.1.2对育成猪群和成猪群应检查：a)鼻塞，不能长时间将鼻端留在粉料中采食；b)两侧内眼角下方颊部形成“泪斑”；c)鼻部和颜部有如下变形：1)上颚短缩，前齿咬合不齐：2)鼻端向一侧弯曲或鼻部向一侧歪斜；3)鼻背部横皱褶逐渐增加；4)眼上缘水平上的鼻梁变平变宽。d)伴有生长欠佳。4.1.3检疫猪群发现有上列症候群，可以临床上初步诊断猪群有支气管败血波氏杆菌1相菌的感染或1SN/T2871-2011与产毒素性多杀巴氏杆菌的混合感染，需要进行细菌学试验予以确诊。4.2AR培养鉴定4.2.1病料采集4.2.1.1根据猪只大小准备棉拭子的长度和粗细，包装密封，高压消毒。4.2.1.2将疑似仔猪仰卧保定，泪斑明显的哺乳猪根据情况采用合适的保定方法，将鼻盘部用75%的酒精擦净、消毒。4.2.1.3将灭菌拭子放人鼻腔中，先通过前庭弯曲部，直达鼻道中部，旋转拭子将鼻分泌物取出。4.2.1.4将拭子放入灭菌的空试管中（不要贴壁推进），或将拭子放人非营养性的培养基中（如：磷酸盐缓冲液)，样品放在4一8保存。4.2.1.5解剖猪时，鼻锯和鼻手术部位应用火焰消毒，拭子由鼻中隔插人筛板，采集两侧鼻腔后部的分泌或拭子由声门插人达气管下部，在气管壁旋转拭子取出气管上下部的分泌物。同时在肺门部位采集肺组织，如有肺炎可在病变部采集组织块；也可以用拭子插入肺断面采集肺液和破碎组织。采集的样品24h内送到实验室接种选择性培养基。4.2.2病原培养4.2.2.1培养基制备用水符合GB/T6682的要求。使用改良的Knight培养基；KPMD培养基、改良的麦康凯培养基、改良的Smith-Baskerville培养基，具体配制方法见附录B。4.2.2.2病原分离培养所有病料都直接涂抹在干燥的选择性平板上。分离Bb可以接种于改良的Knight培养基和KPMD培养基；分离Pm可以接种于改良的麦康凯培养基或改良的Smith-Baskerville培养基。如采集的样品在4一824h以后运输送到实验室的，接种小鼠来提高Pm的分离率，再通过相应的细菌镜检和生化反应，鉴定Bb和T十Pm这两种细菌。4.2.2.3Pm分离物特性鉴定4.2.2.3.1Pm一般特性鉴定4.2.2.3.1.1T+Pm改良的麦康凯培养基的可疑菌落特征是菌落直径约1mm2mm,圆整、光滑、隆起、透明，菌落或呈粘液状融合。4.2.2.3.1.2挑取可疑菌落进行革兰氏染色，T+Pm为革兰氏阴性小杆菌，呈两极染色，散在或成对排列。4.2.2.3.1.3在血平板上出现灰白色菌落。具有以下生化特性：)糖管：包括木糖、葡萄糖、甘露糖及果糖产酸，对乳糖、麦芽糖。阿拉伯糖及杨苷不产酸。b)不产生硫化氢。)氧化酶试验、过氧化氢酶试验以及吲哚试验为阳性。硝酸盐还原试验阳性。4.2.2.3.1.4对分离平板上的可疑菌落，也可先根据三糖铁脲半固体高层小管穿刺生长特点进行筛选。将单个菌落以接种针于斜面中心直插人底层，轻轻由原位抽出，再在斜面上轻轻涂抹，37斜放培养18h。多杀巴氏杆菌生长特点：沿穿刺线呈不扩散生长，高层变橘黄色；斜面呈薄苔生长，变橘红色或橘红黄色：凝结水变橘红色。轻浊生长，无菌膜，不产气、不变黑。2SN/T2871-20114.2.2.3.2Pm荚膜分型4.2.2.3.2.1PD株吖啶黄素的鉴定Pm-D株吖啶黄素的鉴定如下：a)采用新鲜的牛血琼脂板上的培养物接种到约3mL的脑心浸液肉汤中，Pm-D株和Pm-A株为阳性和阴性对照：b)37孵育为18h24h;c)离心出现细菌颗粒和弃上清液2.5mL:d)加人0.5mL0.1%吖啶黄素的中性溶液。吖啶黄素溶液尽量现配现用，最多保存1周，4避光：e)重悬细菌颗粒，在室温下静置孵育；f)5min后观察是否出现絮状沉淀；g)出现絮状沉淀，说明该菌落为Pm-D株。4.2.2.3.2.2PrA株透明质酸酶的鉴定Pm-A株透明质酸酶的鉴定如下：a)制备新鲜牛血清琼脂培养基。Pm-A株和Pm-D株为阳性和阴性对照；b)每株分离株接种到含6%牛血胰酶大豆血液琼脂平板，平行划线，间隔约3mm5mm,每块平板需要新鲜，不能脱水以免产生高浓度的透明质酸：)同时接种可以产生透明质酸酶的金黄色葡萄球菌株接种于每条划线的直角边；d)接种的平板37孵育24h,在加湿的环境下可以观察到Pm-A株靠近金黄色葡萄菌株那端生长明显受到抑制，在远离的一端菌落的生长抑制不明显；e)在阳性和阴性的结果成立的情况下，出现生长抑制的菌落为Pm-A株。4.2.2.3.3Pm抗原分型根据P细胞壁脂多糖的差异可以对抗原进行分型。通过凝胶扩散沉淀试验可以分为16个亚型，猪体内大部分是3型。由于所需的抗血清不齐全，只有参考实验室和部分诊断实验室提供体抗原分型。4.2.2.3.4多杀性巴氏杆菌毒素的测定体重350g400g健康豚鼠，背部两侧注射部剪毛，不能伤及皮肤，皮内注射分离株马丁肉汤3736h(或36h72h)培养物0.1mL。注射点距背中线1.5cm,各注射点相距2cm以上。设阳性及阴性参考菌株和同批马丁肉汤注射点为对照，并在大腿内侧肌注硫酸庆大霉素4万单位(1mL)。注射后24h、48h及72h观察并测量注射点皮肤红肿和坏死区的大小。坏死区直径1.0cm左右为阳性，小于0.5cm为可疑，无反应或仅红肿为阴性。可疑需复试。阳性株对照坏死区直径应大于1.0cm,阴性株及马丁肉汤对照均为阴性。也可以使牛胚胎肺单层细胞(EBL),非洲绿猴肾细胞(Vro)细胞或牛鼻甲细胞发生细胞病变；在心脑肉汤中37孵育24h,离心后过滤上清接种到上述单层细胞中37培养2d3d,用结晶紫染色后在显微镜下可以观察到病变为毒素阳性，无细胞病变的为毒素阴性。4.2.2.4Bb分离物的特征鉴定支气管败血波氏杆菌革兰氏阴性菌，形成1mm2mm大小的菌落，在血琼脂培养48h,通常出现溶血。对氧化酶、过氧化氢酶、柠檬酸、尿素和6.5%氯化钠增长呈阳性反应。一般特性鉴定：)糖管：包括乳糖、葡萄糖、蔗糖在内的所有糖类不氧化不发酵（不产酸、不产气），迅速分解蛋白3