SNT 2135-2008 蜂蜜中转基因成分检测方法 普通PCR方法和实时荧光PCR方法.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 蜂蜜中转基因成分检测方法普通犘 犆 犚方法和实时荧光犘 犆 犚方法犇 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀狅 犳犵 犲 狀 犲 狋 犻 犮 犪 犾 犾 狔犿 狅 犱 犻 犳 犻 犲 犱犮 狅 犿 狆 狅 狀 犲 狀 狋 狊 犻 狀犺 狅 狀 犲 狔犆 狅 狀 狋 犲 狀 狋 犻 狅 狀 犪 犾犘 犆 犚犪 狀 犱狉 犲 犪 犾 狋 犻 犿 犲 犳 犾 狌 狅 狉 犲 狊 犮 犲 狀 犮 犲犘 犆 犚 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售书书书前言本标准的附录 和附录均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局起草。本标准主要起草人：饶红、冯骞、陈广全、付浦博、曾静、汪琦、张惠媛。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售蜂蜜中转基因成分检测方法普通犘 犆 犚方法和实时荧光犘 犆 犚方法范围本标准规定了蜂蜜中转基因成分的定性检测方法。本标准中适用于以转基因棉花、转基因油菜等作为蜜源植物采集的蜂蜜或受到转基因作物污染的蜂蜜中的转基因成分的检测。规范化引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。分析实验室用水规格和试验方法（，：，）基因分析检测实验室技术要求 植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法术语、定义和缩略语 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。聚合酶链式反应狆 狅 犾 狔 犿 犲 狉 犪 狊 犲犮 犺 犪 犻 狀狉 犲 犪 犮 狋 犻 狅 狀，犘 犆 犚体外酶催合成特异 片段的方法，模板基因序列先经高温变性成为单链，在 聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板 两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合，接着在 聚合酶的作用下以四种脱氧核糖（）为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使欲扩增的基因片段以几何倍数扩增。实时荧光犘 犆 犚 狉 犲 犪 犾 狋 犻 犿 犲 犳 犾 狌 狅 狉 犲 狊 犮 犲 狀 犮 犲犘 犆 犚在 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定性或定量分析的方法。扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光集团和一个淬灭荧光集团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；扩增时，犜 犪 狇酶的 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光集团和淬灭荧光基团分离，从而荧光检测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的积累与 产物形成完全同步。就是通过对 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 反应的进行，反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。定性检测狇 狌 犪 犾 犻 狋 犪 狋 犻 狏 犲犱 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀对样品中转基因成分进行检测，以判定该样品是否为转基因产品。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 缩略语 下列缩略语适用于本标准。转基因生物。花椰菜花叶病毒 启动子。犃 犵 狉 狅 犫 犪 犮 狋 犲 狉 犻 狌 犿狋 狌 犿 犲 犳 犪 犮 犻 犲 狀 狊来源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子。莽草酸 磷酸合成酶基因。玉米转化酶基因。新霉素 磷酸转移酶基因。（）：，（）犅 犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊狋 犺 狌 狉 犻 狀 犵 犻 犲 狀 狊 犻 狊 犓 狌 狉 狊 狋 犪 犽 犻狊 狋 犲 犪 犻 狀 犎犇 苏云金芽孢杆菌结晶蛋白 （）型毒素抗虫基因。草丁膦乙酰转移酶基因。来源于杆菌犅 犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊 犪 犿 狔 犾 狅 犾 犻 狇 狌 犲 犳 犪 犮 犻 犲 狀 狊的 基因。犅 犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊 犪 犿 狔 犾 狅 犾 犻 狇 狌 犲 犳 犪 犮 犻 犲 狀 狊来源于杆菌犅 犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊 犪 犿 狔 犾 狅 犾 犻 狇 狌 犲 犳 犪 犮 犻 犲 狀 狊的 基因的特异抑制基因。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因。（）玄参花叶病毒 启动子。抗除草剂基因（）。（）（）（）（）犅 犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊 狋 犺 狌 狉 犻 狀 犵 犻 犲 狀 狊 犻 狊 苏云金芽孢杆菌结晶蛋白（）型毒素抗虫融合基因。草甘麟氧化还原酶基因。（）（）犅 犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊 狋 犺 狌 狉 犻 狀 犵 犻 犲 狀 狊 犻 狊 苏云金芽孢杆菌结晶蛋白 （）型毒素抗虫基因原理蜂蜜中转基因成分检测是利用外源基因与植物本身基因的不同，通过设计只能扩增外源基因中 片段的引物和进行 扩增，根据实验结果，判定该蜂蜜是否带有植物外源基因成分，从而判断蜂蜜中是否含有转基因成分。实时荧光 检测是在常规 基础上加入荧光标记探针来实现核酸定量，由于荧光探针在 反应时被切割的数量与 原始模板量成正相关，因此，可以通过检测荧犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售光信号的强度来推算转基因含量。待测样品中转基因的含量是通过与用一系列已知不同含量的转基因标准品而作出的标准曲线拟合的数学模型计算得出。试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯和生化级试剂。实验用水均为超纯水，规格符合 相关规定。提取液：，（），（），。提 取 液：，（），。沉淀液：，。饱和酚。三氯甲烷。异戊醇。异丙醇。乙醇。氯化钠溶液：氯化钠 。酶（）。琼脂糖。三羟甲基氨基甲烷（）。缓冲液。犜 犪 狇 聚合酶。溴化乙锭（）。电泳缓冲液。电泳上样缓冲液。（巯基乙醇）。实验用水：应符合 中一级水的规格。仪器设备 恒温水浴（）。电子天平（最小精度值 ）。普通离心机（或其他等效设备）。低温高速离心机（或其他等效设备）。制冰机。冰箱。恒温磁力搅拌器。计（，最小显示单位 ，）。移液器（，）。管（）。离心管（，）。仪（或其他等效设备）。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 实时荧光 仪（或其他等效设备）。电泳仪（）。凝胶成像分析系统。核酸蛋白分析仪。抽样与制样 抽样按照 中规定的方法执行。制样将装有蜂蜜样品的容器放置于 水浴中，取样时将蜂蜜搅拌均匀，使下层沉淀物与上层的液体充分混匀后再称取样品。蜂蜜中犇 犖 犃提取方法 犇 犖 犃提取 改良犛 犇 犛方法）称取蜂蜜样品 放入有磁力搅拌子的 小烧杯中，加灭菌双蒸水 ，恒温振荡 ，使蜂蜜样品和水充分混合均匀，转移至 离心管；）犵离心 ，迅速倒掉上清液，保留沉淀。用 （根据沉淀的多少）的去离子水将离心管管壁上的沉淀冲洗下来，转入 离心管中，犵离心 。弃上清液，保留沉淀。若溶液体积达，应分两次转入 离心管中，弃上清液，保留沉淀；）加 预热到 的 提取缓冲液，混匀，转入 离心管中，放入 水浴锅中水浴 ；）犵离心 ，取上清液 ；）加 （终浓度 ），水浴 ；）加入等体积 饱和酚，充分混匀；）犵离心 ，取上清液 ，加入 饱和酚及 三氯甲烷异戊醇（体积比，）混匀；）犵离心 ，取上清液 ，加入等体积三氯甲烷异戊醇（体积比，）混匀；）犵离心 ，取上清液 ，加入两倍体积异丙醇，轻轻混匀，冰浴 ；）犵离心 取沉淀，并用 乙醇清洗次；）倒去乙醇，离心，用吸管尽可能吸去剩余乙醇。干燥后加入 去离子水溶解 。低温（）保存。犆 犜 犃 犅法）称取蜂蜜样品 放入有磁力搅拌子的 小烧杯中，加灭菌双蒸水 ，恒温振荡 ，使蜂蜜样品和水充分混合均匀，转移至 离心管；）犵离心 ，迅速倒掉上清液，保留沉淀。用 （根据沉淀的多少）的去离子水将离心管管壁上的沉淀冲洗下来，转入 离心管中，犵离心 。弃上清液，保留沉淀。若溶液体积达，应分两次转入 离心管中，弃上清液，保留沉淀；）犵离心 ，弃上清液保留沉淀。加入 提取液 和 酶，同时加入终浓度为的 （巯基乙醇），混匀；）转入 离心管，温育 ，取出后置冰上 ，加入等体积 酚三氯甲烷 异戊醇（），混匀，犵离心 ；）取上清液，加入等体积三氯甲烷 异戊醇（），混匀，犵离心 ；犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售）取上清液，加入体积 沉淀液，室温放置 ，犵离心 ；）弃上清液，以 （）溶解沉淀，并加入 三氯甲烷 异戊醇，混匀，犵离心 ；）取上清液，加入 体积异丙醇，室温放置 ，混匀，犵，离心 ；）犵离心 取沉淀，并用 乙醇清洗次；）室温干燥 ，干燥后加入 去离子水溶解 ；）低温（）保存。样品中核酸的定量蜂蜜样品中所提取的 只适合采用紫外分光光度法进行定量，所测得 值为核酸总量。紫外分光光度法检测核酸浓度的最佳范围是 ，值应该在 的区间内。将 溶液做适当的稀释，放入蛋白核酸定量分析仪或紫外分光光度计的比色皿中，于 处测定其吸 收 峰，双 链 或 单 链 。级 溶 液 的 比值为 。定性犘 犆 犚检测 方法概述定性 检测包括对蜂蜜中植物（蜜源植物和非蜜源植物）内源基因和外源基因的检测。通过植物内源基因的检测，和 等外源基因的检测，确定上述主要成分是否含有植物外源基因，从而判定蜂蜜是否被转基因植物污染，可能被何种转基因植物污染。每次 检测须设立相应的阳性对照、阴性对照和试剂空白对照。犘 犆 犚所用引物 扩增所用的引物的序列及扩增片段长度见附录。犘 犆 犚扩增反应体系 扩增反应体系见表。表普通犘 犆 犚检测蜂蜜中内、外源基因的反应体系试剂名称贮备液浓度加样量 反应体系 反应体系 缓冲液 犜 犪 狇酶 正义引物反义引物 模板 加双蒸水至 犘 犆 犚扩增程序 反应参数为：，；，引物的退火温度，个循环；，。引物退火温度见表。反应循环参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当调整。犘 犆 犚产物凝胶电泳用电泳缓冲液配制 的琼脂糖凝胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将 扩 增 产物 分 别与 适量 加 样 缓 冲 液 混 合，点 样。恒 压，电 泳犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 。凝胶成像仪下观察电泳结果，拍照并记录结果。定性犘 犆 犚的验证实验 实时荧光犘 犆 犚检测 扩增反应体系扩增反应的引物见附录，反应体系见表。表实时荧光犘 犆 犚检测蜂蜜中植物内、外源基因的反应体系试剂名称贮备液浓度 反应体系终浓度 缓冲液 犜 犪 狇酶 正义引物反义引物 荧光探针 模板双蒸水补水至 犘 犆 犚扩增程序实时荧光 反应参数为：，；，；个循环，。反应循环参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当调整。反应体系中对照的设置 阳性对照：用含转基因成分的蜂蜜样品提取 作为模板。阴性对照：用不含转基因成分的蜂蜜样品提取的 作为模板。空白对照：用配制反应体系的超纯水代替 模板，检测试剂是否受到污染。结果判定 结果分析 普通犘 犆 犚检验 如果外源筛选基因（、等）中有一个检测结果为阳性，而阴性对照和空白对照未出现条带，内源基因和阳性对照出现预期大小的扩增条带，可初步判定该批样品可能带有转基因成分，可进一步检测外源基因以确认是何种转基因植物污染了蜂蜜样品。如果用覆盖待检样品所有转基因品种的筛选基因进行检测均为阴性，阴性对照和空白对照未出现条带，内源基因和阳性对照出现预期大小的扩增条带，则可以判定该样品不含转基因成分。如果不属于上述两种情况，则应采用实时荧光 检测方法进行验证。实时荧光犘 犆 犚定性检验 待检样品外源基因检测 大于或等于，内参照基因检测值小于或等于，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判定为该样品中未检出该外源基因。待检样品外源基因检测 值小于或等于，内参照基因检测值小于，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判定为该样品中检出该外源基因。待检样品外源基因检测 值在