SNT 1961.2-2007 食品中过敏原成分检测方法 第2部分：实时荧光PCR法检测花生成分.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1961.2-2007食品中过敏原成分检测方法第2部分：实时荧光PCR法检测花生成分Detection of allergen components in food-Part 2:Protocol of the real-time fluorescent PCR for detecting peanut component2007-08-06发布2008-03-01实施中华人民共和国数码防伪国家质量监督检验检疫总局发布SN/T1961.2-2007前言SN/T1961食品中过敏原成分检测方法分为两个部分：第1部分：酶联免疫法检测花生成分；一第2部分：实时荧光PCR法检测花生成分。本部分为SN/T1961的第2部分。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本部分主要起草人：张霞、高旗利、罗茂凰、郑文杰、张海滨、张海英、黎径。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。SN/T1961.2-2007食品中过敏原成分检测方法第2部分：实时荧光PR法检测花生成分1范围SN/T1961的本部分规定了食品中过敏原花生成分的实时荧光PCR检测方法。本部分适用于检测糕点、糖果、冰淇淋等食品中过敏原花生成分，其他食品可参照使用。2术语、定义和缩略语2.1术语和定义下列术语和定义适用于SN/T1961的本部分。2.1.1实时荧光PCR real-time fluorescent,PCR实时荧光PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR过程，最后通过荧光信号的增幅进行定性分析。2.2缩略语下列缩略语适用于SN/T1961的本部分。2.2.1Ct值：C:cycle,T:threshold,每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。2.2.2PCR:polymerase chain reaction,聚合酶链式反应，简称PCR。2.2.3DNA:deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸。2.2.4dNTP:deoxyribonucleoside triphosphate,脱氧核苷三磷酸。2.2.5dATP:deoxyadenosine triphosphate,脱氧腺苷三磷酸。2.2.6dCTP:deoxycytidine triphosphate,脱氧胞苷三磷酸。2.2.7dGTP:deoxyguanosine triphosphate,脱氧鸟苷三磷酸。2.2.8dTTP:deoxythymidine triphosphate,脱氧胸苷三磷酸。2.2.9dUTP:deoxyuridine triphosphate,脱氧尿苷三磷酸。2.2.10UDG:uracil DNA glycosylase,尿密啶DNA-糖基化酶。2.2.11bp:base pair,碱基对。2.2.12Taq:Thermus aquaticu,水生栖热菌。2.2.13Tris:tris(hydroxymethyl)aminomethane,三（羟甲基）氨基甲烷。2.2.14TE:Tris-HCl、EDTA缓冲液。3检测方法3.1方法提要食品经研磨后，提取DNA,以DNA为模板进行实时荧光PCR扩增，检测食品中是否存在过敏原花生成分。3.2试剂和材料除另有规定外，试剂为优级纯或生化试剂，水为灭菌双蒸水。3.2.1CTAB缓冲液：55mmol/L CTAB、1400mmol/L氯化钠(NaCl)、20mmol/L EDTA、100mmol/L Tris,用10%盐酸(HC1)调pH至8.0,121，20min高压灭菌，储存于28备用。1SN/T1961.2-20073.2.2TE缓冲液：10mmol/L Tris、150mmol/L氯化钠(NaCI)、2mmol/L EDTA、1%十二烷基磺酸钠，用10%HC1调pH至8.0,121，20min高压灭菌，储存于28备用。3.2.3蛋白酶K(20mg/mL)。3.2.4RNA酶溶液(5g/L)。3.2.5Tris饱和酚。3.2.6酚：三氯甲烷：异戊醇(25：24：1)：三氯甲烷：异戊醇(24：1)。3.2.7异丙醇。3.2.870%乙醇3.2.9 10 mmol/L Tris-HCl(pH9.0).3.2.10引物：5-GCAACAGGAGCAACAGTTCAAG-35 CGCTGTGGTGCCCTAAGG-33.2.11探针：5(FAM)-AGCTCAGGAACTTGCCTCAACAGTGCG(Eclipse)-33.2.12 Tag DNA热启动聚合酶3.2.13dNTP:dATP、dTTP、dCTp、dG3.2.1410PCR缓冲液：200mmol/L Tris-HCI(PH8.4)、200mmol/L氯化钾(KC1)、15mmol/L氯化镁(MgCl2).3.3仪器和设备3.3.1天平：量程2kg,感量0.1g量程2kg,感量0.01g3.3.2实时荧光PCR仪。3.3.3冷冻离心机。3.3.4pH计。3.3.5移液器：2L10L、10L100L、100L1000L。3.3.6振荡器。3.3.7研钵及粉碎装置。3.4检测程序过敏原花生成分实时荧光P(R检测程序见图1。品508研成粉称取300mg粉状样品提取】实时荧光PCR检测阴性阳性报告结果图1过敏原花生成分实时荧光PCR检测程序图2SN/T1961.2-20073.5步骤3.5.1制样方法称取约200g样品，用洁净研钵或合适的粉碎装置将样品粉碎至粉末状。3.5.2模板DNA提取3.5.2.1CTAB法称取300mg已制备好的样品至2mL离心管中，加入600 L CTAB(若样品吸水性强适当增加CTAB加入量)、40L蛋白酶K,振荡均匀，65温育30min:加人500L酚：三氯甲烷：异戊醇(25:24:1),强烈振荡，12000r/min离心15min;吸取上层水相至1.5mL离心管中，加人等体积异丙醇，振荡均匀，12000r/min离心10min:弃上清液，用预热至65TE缓冲液溶解DNA(TE量视DNA沉淀的多少而定)；加入5 L RNA酶溶液，37温育30min:加人200uL三氯甲烷：异戊醇(24:1),强烈振荡，12000r/min离心15min;吸取上层水相至新的1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇，振荡均匀，12000r/min离心10min:弃上清液，加入70%乙醇小心清洗沉淀DNA,12000r/min离心1min;弃上清液，干燥，加预热至65TE缓冲液溶解DNA。每个样品做两个平行样，同时设立试剂提取对照（以水代替样品）。3.5.2.2商品化试剂盒方法商品化基因组提取试剂盒，使用时按照操作说明书进行操作。3.5.2.3所提取样品DNA的质量评估样品中提取的DNA用紫外分光光度法检测，分别计算核酸的纯度及浓度，计算见式(1)、式(2)：DNA纯度=OD260m/OD280m*4(1)比值在1.72.0之间较好，符合PCR检测要求。双链DNA浓度(4g/mL)=50XOD2som0(2）3.5.3实时荧光PCR扩增3.5.3.1反应体系10PCR缓冲液5L、引物对(10mol/L)各2L、探针(10mol/L)1.5L、dNTP(10mmol/L)1L、Tag DNA热启动聚合酶(5U/L)0.5L、模板DNA0.1g2g、补水至50L。3.5.3.2反应参数”预变性9510min,1个循环；9515s,601min,同时收集FAM荧光，进行45个循环。3.5.4质控设置进行检测时反应体系应设置阳性对照、阴性对照、提取对照。3.5.4.1阳性对照以花生DNA为模板或采用含有扩增片段（花生Arah2基因序列）的质粒DNA作为模板。3.5.4.2阴性对照采用非花生成分的DNA作为模板。3.5.4.3提取对照采用试剂提取对照作为模板。4结果分析及判定4.1基线的设置实时荧光PCR反应结束后进行结果分析时，应设置基线范围。基线范围选择一般在6个15个循环，如果有强阳性样本，应根据实际情况调整基线范围。阈值设置原则以阈值线好超过正常阴性对照扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且C1值不出现任何数值为准。1)不同仪器，不同Taq DNA热启动聚合酶可根据要求将反应参数做适当调整。