SNT 2754.10-2011 出口食品中致病菌环介导恒温扩增(LAMP)检测方法 第10部分：产气荚膜梭菌.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 出口食品中致病菌环介导恒温扩增（犔 犃犕犘）检测方法第 部分：产气荚膜梭菌犔 狅 狅 狆 犿 犲 犱 犻 犪 狋 犲 犱 犻 狊 狅 狋 犺 犲 狉 犿 犪 犾 犪 犿 狆 犾 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀犱 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀犿 犲 狋 犺 狅 犱犳 狅 狉狆 犪 狋 犺 狅 犵 犲 狀 狊犻 狀犲 狓 狆 狅 狉 狋 犳 狅 狅 犱犘 犪 狉 狋 ：犆 犾 狅 狊 狋 狉 犻 犱 犻 狌 犿狆 犲 狉 犳 狉 犻 狀 犵 犲 狀 狊 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言 出口食品中致病菌环介导恒温扩增（）检测方法 共分为 个部分：第部分：金黄色葡萄球菌；第部分：大肠杆菌 ；第部分：志贺氏菌；第部分：单核细胞增生李斯特菌；第部分：副溶血性弧菌；第部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌；第部分：空肠弯曲菌；第部分：肺炎克雷伯氏菌；第部分：溶血性链球菌；第 部分：产气荚膜梭菌；第 部分：产霍乱毒素的霍乱弧菌；第 部分：溶藻弧菌；第 部分：创伤弧菌；第 部分：假结核耶尔森氏菌；第 部分：阪崎肠杆菌。本部分为 的第 部分。本部分按照 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、中华人民共和国盐城出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、广州华峰生物科技有限公司。本部分主要起草人：游淑珠、王小玉、冯家望、邝筱珊、徐帮兴、李志勇、曹以诚、杜正平、成晓维、杨一帆、王志强、陈洵、高东微。犛 犖犜 出口食品中致病菌环介导恒温扩增（犔 犃犕犘）检测方法第 部分：产气荚膜梭菌范围 的本部分规定了检测出口食品中产气荚膜梭菌的环介导恒温核酸扩增（）法。本部分适用于出口食品中产气荚膜梭菌的筛选检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验 分析实验室用水规格和试验方法 实验室生物安全通用要求 实验室质量控制规范食品分子生物学检测生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测产气荚膜梭菌，所有培养物和废弃物应按照 中的有关规定执行。防污染措施防止污染措施应符合 的规定。缩略语下列缩略语适用于本文件。：甜菜碱犅 狊 狋酶犅 狊 狋 （）：犅 狊 狋 聚合酶（大片段）（）：脱氧核糖核酸 （）：脱氧核苷三磷酸 （）：乙二胺四乙酸（）：环介导恒温扩增 ：聚乙二醇辛基苯基醚技术概要根据产气荚膜梭菌特有的靶序列 基因（参见附录）设计的两对特殊的内、外引物，特异犛 犖犜 性识别靶序列上的六个独立区域，利用犅 狊 狋酶启动循环链置换反应，在 基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎 环 混合物；从 析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的 结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。试剂和材料除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合 中一级水的要求。引物：根据产气荚膜梭菌特有的靶序列 基因设计一套特异性引物，包括外引物，外引物和内引物，内引物。外引物扩增片段长度：。外引物（，）：外引物（，）：内引物（，）：内引物（，）：提取试剂。缓冲液：；。溶菌酶溶液。蛋白酶 溶液。氯化钠。溶液：；。三氯甲烷异戊醇（）。饱和酚。乙酸钠（）。无水乙醇。乙醇。缓 冲 液 含：，氯 化 钾，硫 酸 铵，硫酸镁，。：每种核苷酸浓度 。甜菜碱：浓度 。硫酸镁（）：浓度 。犅 狊 狋 聚合酶：酶浓度。显色液：荧光染料，。阳性对照：产气荚膜梭菌标准菌株，或含目的片段的 亦可。产气荚膜梭菌 检测试剂盒），可选，参照试剂盒说明书操作。试剂盒组成及使用注意事项参见附录。塑料离心管。）由广州华峰生物科技有限公司提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。犛 犖犜 仪器和设备 移液器：量程 ；量程 ；量程 。高速台式离心机：犵 水浴锅或加热模块：和 。计时器。检测程序食品中产气荚膜梭菌 检测程序见图。图食品中产气荚膜梭菌犔 犃犕犘检测程序 操作步骤）样品制备、增菌培养按照 的方法制备样品匀液，获得可疑黑色菌落。细菌模板犇 犖 犃的制备）样品匀液模板犇 犖 犃的制备对于 获得的样品匀液，采用如下方法制备模板 ：）取样品匀液 于 离心管，犵离心 ，去上清液；）加入 洗涤菌体一次，犵离心 ，去上清液；）加入 （）充分振荡，重悬菌体；）采用以下方法，也可使用产气荚膜梭菌 检测试剂盒按照说明书操作。）采用下述方法，也可使用等效的商品化的 提取试剂盒并按其说明提取制备模板 。）往管中加入 溶菌酶溶液（，）至终浓度 ，混匀，犛 犖犜 反应，并每 振荡一次；）加入 蛋白酶（），混匀，反应；）加入 至终浓度，混匀，温浴 ；）加入 氯化钠，混匀，温浴 ；）加入等体积三氯甲烷异戊醇（），充分混匀，犵离心 ；）小心移取上清液至 离心管中，加入等体积酚三氯甲烷异戊醇（），充分混匀，犵离心 ；）小心移取上清液至 离心管中，加入 体积的 乙酸钠（）以及倍体积的冰冻无水乙醇，混匀，观察是否有絮状沉淀，放置 或者更长时间；）犵离心，去上清液；）加入冰冻 乙醇洗涤沉淀，犵离心，去上清液；）沉淀置通风橱风干（约 ），加入 （）溶解沉淀；）加入 ，反应 ；）加入 （）和等体积酚三氯甲烷异戊醇（），充分混匀，犵离心 ；）小心移取上清液至 离心管中，加入 体积的 乙酸钠（）和倍体积的冰冻无水乙醇，混匀，放置 或者更长时间；）犵离心，去上清液；）加入冰冻 乙醇洗涤沉淀，犵离心 ，弃去上清液；）沉淀置通风橱风干后，加入适量 （）或者无菌水溶解，可立即使用或置 存放个月备用。可疑菌落模板犇 犖 犃的制备对于 分离到的可疑菌落，可直接挑取可疑菌落，再按照 ）步骤制备模板 以待检测。环介导恒温核酸扩增 反应体系产气荚膜梭菌 反应体系见表。表产气荚膜梭菌犔 犃犕犘反应体系组分工作液浓度加样量反应体系终浓度 缓冲液 甜菜碱 犛 犖犜 表（续）组分工作液浓度加样量反应体系终浓度硫酸镁 犅 狊 狋 聚合酶 模板 去离子水 反应过程 按表所述配制反应体系。扩增 。空白对照、阴性对照、阳性对照设置每次反应应设置阴性对照、空白对照和阳性对照。空白对照以水替代 模板。阴性对照以提取空白代替模板 。也可使用产气荚膜梭菌 检测试剂盒中的阴性对照。阳性对照制备：将产气荚膜梭菌标准菌株接种于液体硫乙醇酸盐培养基营养肉汤中 培养 ，用无菌生理盐水稀释至约 （约麦氏浊度），按 提取模板 作为 反应的模板。也可使用产气荚膜梭菌 检测试剂盒中的阳性对照。结果观察在上述反应管中加入显色液，轻轻混匀并在黑色背景下观察。建议使用 试剂盒专用反应管，将反应液和显色液一次性加入，扩增反应后可不必开盖即可观察结果。结果判定和报告在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：）待检样品反应管液体呈绿色，该样品结果为产气荚膜梭菌初筛阳性，对样品匀液或可疑纯菌落进一步按 中操作步骤进行确认后报告结果；）待检样品反应管液体呈橙色则可报告产气荚膜梭菌检验结果为阴性。若与上述条件不符，则本次检测结果无效，应更换试剂按本方法重新检测。犛 犖犜 附录犃（资料性附录）产气荚膜梭菌 犛 狉 犚 犖 犃基因序列犃 产气荚膜梭菌 犛 狉 犚 犖 犃基因序列（犪 犮 犮 犲 狊 狊 犻 狅 狀狀 狅 犌 犙 ）注：阴影所示部分为 基因序列。犃 组成引物中碱基构成注：其中阴影部分 为连接序列。犛 犖犜 附录犅（资料性附录）产气荚膜梭菌犔 犃犕犘检测试剂盒犅 试剂盒组成每个试剂盒（，每个反应体系体积为）包括以下成分：提取液；反应液；犅 狊 狋酶；显色液；稳定液；阳性对照；阴性对照。犅 说明犅 试剂盒内各试剂使用前，充分融化后稍离心。犅 试剂盒内的阳性对照应视为具有污染性物质，应注意避免污染其他样品和反应试剂，导致错误检验结果。犛 犖犜