SNT 2651-2010 肉及肉制品中常见致病菌检测方法 基因芯片法.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 肉及肉制品中常见致病菌检测方法基因芯片法犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳狆 犪 狋 犺 狅 犵 犲 狀 犻 犮犫 犪 犮 狋 犲 狉 犻 犪 犻 狀犿 犲 犪 狋 犪 狀 犱犿 犲 犪 狋狆 狉 狅 犱 狌 犮 狋 狊犌 犲 狀 犲犮 犺 犻 狆犿 犲 狋 犺 狅 犱 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国重庆出入境检验检疫局、博奥生物有限公司暨生物芯片北京国家工程研究中心。本标准主要起草人：肖进文、李应国、刘生峰、王昱、聂福平、谭志、周庆、张亮、臧庆伟。犛 犖犜 肉及肉制品中常见致病菌检测方法基因芯片法范围本标准规定了肉及肉制品中沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲杆菌和大肠杆菌 ：的基因芯片检测方法。本标准适用于肉及肉制品中沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲杆菌和大肠杆菌 ：的基因芯片检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。实验室生物安全通用要求 实验室质量控制规范食品分子生物学检验 出口食品中沙门氏菌（包括亚利桑那菌）检验方法 出口食品中金黄色葡萄球菌检验方法 出口食品中弯曲杆菌检验方法 出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法 进出口肉、肉制品以及其他食品中肠出血性大肠杆菌 ：检验方法术语和定义下列术语和定义适用于本文件。基因芯片犇 犖 犃犮 犺 犻 狆核酸检测探针按照有序的行列格式点制在固相支持物上，通过特定温度下与相应样品进行杂交而用于样品中核酸种类定性分析的一种高通量技术。生物安全要求 环境要求实验室的安全防护按照 中的有关规定执行。废弃物处理和防止污染措施检测过程中的废弃物需经 高压灭菌处理至少 后再弃置。检测过程中防止交叉污染的措施按照标准 的规定执行。犛 犖犜 方法概述针对种目标菌保守基因片段设计引物，提取待检样品增菌液的 为模板进行两个独立的多重 扩增。扩增产物与固定有种目标致病菌特异性探针的基因芯片进行杂交，用芯片扫描仪对杂交芯片进行扫描并判定结果。阳性结果用传统方法确证。设备和材料 高压灭菌锅。恒温培养箱。微需氧培养装置。高速离心机（犵以上）。水浴锅（、）。超净工作台。仪。水平式电泳仪。凝胶成像分析系统。水浴摇床 基因芯片扫描仪。基因芯片清洗仪（可选）。芯片杂交盒。微量可调移液器和灭菌吸头：、。灭菌 反应管。培养基和试剂 缓冲胨水增菌液（）（见附录）。四硫磺酸盐煌绿增菌液（）（见附录）。改良缓冲蛋白胨水（）（见附录）。增菌培养液（）（见附录）。氯化钠胰蛋白胨大豆肉汤（见附录）。弯曲杆菌增菌肉汤（见附录）。改良 新生霉素增菌肉汤（）（见附录）。电泳级琼脂糖 晶芯?食源性致病微生物检测芯片试剂盒）引物序列（参见附录）。芯片探针序列（参见附录）。缓冲液：和 ，。缓冲液：盐酸胍。）该试剂盒是博奥生物有限公司提供的产品的商品名，是适合的市售产品的实例，给出这一信息是方便本标准的使用者，并不表示对这一产品的认可。如果其他等效产品具有相同功效，则可使用这些等效产品。犛 犖犜 去蛋白液：盐酸胍。漂洗液：缓冲液，。蛋白酶。吸附柱 和收集管。溶液。洗脱缓冲液：缓冲液，。（组成参见附录）。（组成参见附录）。犜 犪 狇酶（）。阳性质控基因组（）。（）。载样液。分子量标记 。洗涤液：，（参见附录）。洗涤液：（参见附录）。检测芯片。检测程序检测流程见图。图基因芯片法检测肉及肉制品中致病菌流程图犛 犖犜 操作步骤 增菌 沙门氏菌增菌按 要求，对样品进行增菌培养。单核细胞增生李斯特氏菌增菌按 要求，对样品进行增菌培养。金黄色葡萄球菌增菌按 要求，对样品进行增菌培养。空肠弯曲杆菌增菌按 要求，对样品进行增菌培养。大肠杆菌 ：增菌按 要求，对样品进行增菌培养。细菌基因组犇 犖 犃提取 取上述种增菌培养液各 至一个 无菌离心管中混匀，从中取 至一个 无菌离心管中，离心 。取上清液 到另一新的离心管中，离心 。弃掉上清液，沉淀中加入 缓冲液，振荡至菌体彻底悬浮。作用。加入 溶液，振荡，室温放置 。注：余下的混合增菌液应放入冰箱，以备后期芯片检测阳性样品的确证实验用。向管中加入 蛋白酶溶液，混匀后加入 缓冲液，振荡 ，放置 。简短离心以去除管盖内壁的水珠。加 无水乙醇，充分振荡混匀。简短离心以去除管盖内壁的水珠。将全部液体转移到吸附柱中。向吸附柱中加入 去蛋白液，离心 ，倒掉废液，吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入 漂洗液，离心 。倒掉废液，吸附柱放入收集管中。向吸附柱加入 漂洗液，离心 ，倒掉废液。吸附柱放回收集管中，离心 ，去除吸附柱中残余的漂洗液。将吸附柱置于室温或 温箱放置 ，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 经 水浴预热的洗脱缓冲液，室温放置 ，离心 。再次向吸附膜的中间部位悬空滴加 经 水浴预热的洗脱缓冲液，室温放置 ，离心 。回收得到的 产物于 冰箱保存备用。结果检测。用 的琼脂糖凝胶电泳检测 提取物。细菌基因组 通过琼脂糖凝胶电泳，出现的电泳条带位置在 以上，且清晰可见。犘 犆 犚扩增 将提取的细菌基因组 同时用两个 反应体系进行扩增，电泳检测 扩增产物。反应体系的配制如表。表犘 犆 犚反应体系单位为微升反应液组成检测反应阳性质控阴性质控 犜 犪 狇（）细菌基因组 犛 犖犜 表（续）单位为微升反应液组成检测反应阳性质控阴性质控阳性质控基因组 无核酸酶灭菌水 反应体系的配制如表。表犘 犆 犚反应体系单位为微升反应液组成检测反应阳性质控阴性质控 犜 犪 狇（）细菌基因组 阳性质控基因组 无核酸酶灭菌水 反应的循环参数：预变性 ；进入循环，、，共 个循环；最后 延伸 。扩增结果检测：反应结束后取扩增产物加入 载样液，用 的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。若在 之间出现明显的扩增条带，即可进行芯片杂交实验。注：如果在此片段范围内无可见扩增条带，同时阳性质控也无可见扩增条带，则可能为扩增失败，建议更换另一批次的 扩增试剂，重新扩增。芯片杂交 杂交体系配制：将杂交液置 水浴预热 ，按表配制。表杂交体系组分体积杂交液种 扩增产物各 总体积 变性：将杂交体系 变性 ，冰浴 。杂交：将杂交盒平放在桌面上，在杂交盒的两边凹槽内加入约 灭菌水，将固定有探针片段的芯片放入杂交盒内，芯片标签正面朝上；揭掉芯片盖片的塑料薄膜，放在芯片的黑色围栏上，凸块的一面对着芯片；然后从盖玻片的小孔缓慢注入 变性后的杂交液。不要振动盖玻片或芯片以避免破坏液膜。盖紧杂交盒盖，放入 恒温水浴中，静置，杂交以上。芯片洗涤：）手动清洗：按需要量配制好芯片洗液和涤液，并在 预热 。取出杂交后芯片，将芯片放在预热好的洗液中，水浴摇床振荡清洗 ，再转入预热好的洗液中，犛 犖犜 水浴摇床振荡清洗 。最后用 预热好清水中振荡清洗一次，清洗后的 芯 片 经 离心 以去除芯片表面的液体。此芯片可避光保存，在内扫描结果；）芯片清洗仪清洗：按需要量配制好芯片洗液和洗液。按仪器操作说明书要求将芯片清洗仪开机预热，待预热完成后将芯片放入清洗槽中开始清洗，清洗完成后，将芯片放入清洗仪器的离心腔中离心甩干。芯片扫描及结果判读 芯片杂交结果扫描：使用微阵列芯片扫描仪对洗净杂交后的芯片进行扫描分析。结果的判定标准：）信号值背景信号平均值背景信号值标准差，且信号值阴性对照信号平均值阴性对照信号值标准差，探针杂交结果为阳性；）背景信号平均值背景信号值标准差信号值背景信号平均值背景信号值标准差，且阴性对照信号平均值阴性对照信号值标准差信号值阴性对照信号平均值阴性对照信号值标准差，探针杂交结果为疑似；）信号值背景信号平均值背景信号值标准差，且信号值阴性对照信号平均值阴性对照信号值标准差，探针杂交结果为阴性。结果报告若芯片检测结果为阴性，则结果报告为相应的微生物阴性；若检测结果为阳性或者疑似，则分别按照下列标准进行进一步确证：；。犛 犖犜 附录犃（规范性附录）培养基的配制犃 缓冲胨水增菌液（犅 犘）蛋白胨 氯化钠 磷酸氢二钠（含 个结晶水）磷酸二氢钾 蒸馏水 将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约 ，加热煮沸至完全溶解，调至 ，高压灭菌 ，临用时，以无菌操作分装灭菌玻璃瓶，每瓶 或 。犃 四硫磺酸盐煌绿增菌液（犜 犜 犅）犃 基础液蛋白胨 牛肉膏 氯化钠 碳酸钙 蒸馏水 除碳酸钙外，将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约 ，加热煮沸至完全溶解，再加入碳酸钙，调至 ，高压灭菌 。犃 硫代硫酸钠溶液硫代硫酸钠（含个结晶水）蒸馏水：加至 高压灭菌 。犃 碘溶液碘片 碘化钾 蒸馏水加至 将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中，再投入碘片，振摇玻璃瓶至碘片完全溶解，然后加蒸馏水至规定的总量，储存于褐色瓶内，塞紧瓶盖备用。犃 煌绿水溶液煌绿 蒸馏水 犛 犖犜 溶解后，存放暗处，不少于，使其自然灭菌。犃 牛胆盐溶液牛胆盐 蒸馏水 加热煮沸至完全溶解，高压灭菌 。犃 制备基础液 硫代硫酸钠溶液 碘溶液 煌绿水溶液 牛胆盐溶液 临用前，按上列顺序，以无菌操作依次加入基础液中，每加入一种成分，均应摇匀后再加入另一种成分，最后分装于灭菌玻璃瓶内，每瓶 或 。犃 改良缓冲蛋白胨水（犕犅 犘）犃 缓冲蛋白胨水蛋白胨 氯化钠 磷酸氢二钠 磷酸二氢钾 蒸馏水 将各成分加热煮沸溶解，冷却后调整至 ，分装 于广口瓶或三角瓶内，于 高压灭菌 。犃 盐酸吖啶黄溶液盐酸吖啶黄素 灭菌蒸馏水 振摇均匀，充分溶解后过滤除菌。犃 萘啶酮酸溶液萘啶酮酸 氢氧化钠溶液 振摇混匀，充分溶解后过滤除菌。犃 改良缓冲蛋白胨水（犕犅 犘）缓冲蛋白胨水 盐酸吖啶黄溶液 萘啶酮酸溶液 使用前加入盐酸吖啶黄溶液和萘啶酮酸溶液，充分振摇，混合均匀。犛 犖犜 犃 增菌培养液（犈 犅）犃 胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤（犜 犛 犅 犢 犈）胰酪蛋白胨（或胰蛋白胨）植物（大豆）蛋白胨 氯化钠 磷酸氢二钾 葡萄糖 酵母浸膏 蒸馏水 将各成分加热煮沸溶解，冷却后调整至 ，分装于三角瓶中，每瓶 ，于 高压灭菌 。犃 增菌培养液（犈 犅）胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤（）盐酸吖啶黄溶液 萘啶酮酸溶液 使用前加入盐酸吖啶黄溶液和萘啶酮酸溶液，充分振摇，混合均匀。犃 氯化钠胰蛋白胨大豆肉汤胰蛋白胨 植物蛋白胨 氯化钠 磷酸氢二钾 葡萄糖 蒸馏水 将各成分完全溶于蒸馏水中，分装于试管或玻璃瓶，高压灭菌 ，最终 。犃 弯曲杆菌增菌肉汤犃 基础液（布氏肉汤）胰蛋白胨 蛋白胨 葡萄糖 酵母浸膏 氯化钠 亚硫酸氢钠（）蒸馏水 将各成分溶于蒸馏水中，高压灭菌 ，最终 ，分装于规格适宜的烧瓶。犛 犖犜 犃 犉 犅 犘浓原液硫酸亚铁 焦亚硫酸钠 丙酮酸钠 将各成分溶于 蒸馏水中，经 滤膜过滤除菌，每 经灭菌的基础液中加，混匀。犃 号抗生素溶液万古霉素 三甲氧苄氨嘧啶乳酸盐 多粘菌素 将各成分溶于 蒸馏水中，经 滤膜过滤除菌，每 经灭菌的基础液中加。犃 号抗生素溶液利福平 三甲氧苄氨嘧啶乳酸盐 多粘菌素 放线菌酮 将各成分置 容量瓶中，加入 乙醇 ，振摇使溶解，加入蒸馏水至 ，过滤除菌，每 经高压灭菌的基础液中加。犃 改良犈 犆新生霉素增菌肉汤犿（犈 犆）狀胰蛋白胨 号胆盐 乳糖 无水磷酸氢二钾 无水磷酸二氢钾 氯化钠 蒸馏水 将上述成分溶于水后校正 至，分装后 灭菌 ，取出后冷却至室温，以过滤灭菌的新生霉素溶液 加入，使最终浓度为 。犛 犖犜 附录犅（资料性附录）方法的引物及探针犅 引物 反应使用的引物序列如表。表犅 犘 犆 犚反应使用的引物序列物种目标基因引物名称序列扩增片段大小 弯曲杆菌、李斯特氏 菌、沙 门 氏 菌、金黄色葡萄球菌 约 大肠杆菌 ：沙门氏菌、空肠弯曲杆菌 单 核 细 胞 增 生 李斯特氏菌 注：对于核酸序列，除了、分别代表各种核酸之外，代表或（嘌呤）；代表或（