DB32T 4139-2021 小麦赤霉病菌抗药性监测技术规程.doc

ICS 65.020.20 CCS B 22       DB32 江苏省地方标准 DB 32/ T 4139—2021       小麦赤霉病菌抗药性监测技术规程 Technical regulation for monitoring of fungicide resistance in Fusarium spp. causing wheat head blight             2021 - 11 - 04发布 2021 - 12 -04实施 江苏省市场监督管理局   发布 DB32/T 4139-2021 前  言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。 本文件由南京农业大学提出。 本文件由江苏省农作物标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：南京农业大学、江苏省植物保护植物检疫站。 本文件主要起草人：周明国、侯毅平、段亚冰、王建新、张绍明、朱阿秀。 4 小麦赤霉病菌抗药性监测技术规程 1 范围 本文件规定了小麦赤霉病菌抗药性监测对象、敏感性基线确定、采样与分离、敏感性测定等技术要求。 本文件适用于小麦赤霉病菌对常用杀菌剂抗性监测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 1156.1—2006 农药室内生物测定试验准则 杀菌剂第1部分：抑制病原真菌孢子萌发试验 凹玻片法 NY/T 1156.2—2006农药室内生物测定试验准则 杀菌剂第2部分：抑制病原真菌菌丝生长试验 平皿法 NY/T 1859.1 农药抗性风险评估第1部分：总则 NY/T 1859.6 农药抗性风险评估第6部分：灰霉病菌抗药性风险评估 3 术语和定义 NY/T 1859.1和NY/T 1859.6界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 区分剂量 critical concentration 能够鉴别抗药性菌株和敏感菌株的药剂浓度。 4 监测对象 监测对象包括： a) 苯并咪唑类杀菌剂：多菌灵、甲基硫菌灵 b) 麦角甾醇生物合成抑制剂：戊唑醇、丙硫菌唑、叶菌唑、丙环唑、三唑酮、咪鲜胺、己唑醇、氟环唑、苯醚甲环唑 c) 甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂：嘧菌酯、吡唑醚菌酯、醚菌酯、烯肟菌酯、肟菌酯 d) 琥珀酸脱氢酶抑制剂：氟唑菌酰羟胺、萎锈灵 e) 肌球蛋白抑制剂：氰烯菌酯 f) 多作用位点杀菌剂：福美双、百菌清 5 敏感性基线确定 按照NY/1859.6执行。 6 采样与分离 6.1 采样 小麦收获前在多个代表性监测点采集赤霉病发病的麦穗，或在小麦抽穗前20至25天采集含病残体的稻桩。采集的每个样本分别装入1个纸质信封，并记录采样人及联系方式、采样的小麦品种、用药情况及地点（省、市县、乡镇、村、组、农户）。做好记录并将样品晾干防止霉变。 6.2 分离 挑取稻桩上的病残体或麦穗上的病麦粒，放在含有50 μg/mL五氯硝基苯和100 μg/mL硫酸链霉素的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA，Potato Dextrose Agar）平板上，分离小麦赤霉病菌。 7 敏感性测定 7.1 药剂配制 将有效含量90%以上的杀菌剂原药溶解在合适的溶剂中，制成10 mg/mL的母液，现配现用。 7.2 测定方法 7.2.1 菌丝生长速率测定法 本方法适用于监测对所有登记药剂的抗药性。将分离的小麦赤霉病菌接种至含区分剂量药剂培养基上，25℃黑暗培养3天，观察菌株生长情况，能生长的即为抗性菌株，不生长的即为敏感菌株。具体步骤按照NY/T 1156.2—2006。 7.2.2 孢子萌发测定法 本方法适用于监测对甲氧基丙烯酸酯类和琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂的抗药性。制备各菌株的分生孢子或子囊孢子，用无菌水稀释至约104-5个/mL孢子液，吸取100 μL孢子液均匀涂布在含有不同药剂浓度的水琼脂平板上，在25ºC下黑暗培养6至8小时（对照萌发95%时），显微镜下检查孢子的萌发率（芽管长度达孢子宽度的1/2即为萌发），计算各菌株的EC50值和抗药性指数。具体步骤按照NY/T 1156.1—2006。 7.2.3 LAMP高通量测定法 本方法适用于监测因小麦赤霉病菌β2-Tubulin的F167Y基因型突变引起的多菌灵抗性。根据LAMP扩增产物的颜色可判定菌株是否为多菌灵抗性，具体技术方法按照附录A执行。 8 抗药性评价 8.1 抗药性频率及风险评价 抗药性频率（%）=抗药性菌株数/测定菌株数´100。抗药性频率5%以下，为低等风险；抗药性频率为5%～10%为中等风险；抗药性频率10%以上为高等风险。 8.2 影响抗药性风险的其他因素 8.2.1 抗药性指数 抗药性指数5～20，为低等抗性水平；抗药性指数为20～100为中等抗性水平；抗药性指数大于100为高等抗性水平。抗药性群体的抗药性指数越大，抗性风险越大。 8.2.2 交互抗性模式 当测定到抗性菌株时，则进一步测定其对其他杀菌剂的交互抗性。具体按照NY/1859.6执行。若与其他药剂有交互抗性，则一定程度上加大了抗性风险。 8.2.3 田间种植方式 单一种植同一小麦品种，有利于抗药性群体的发展。 8.2.4 田间气候条件 合适的温度、湿度有利于小麦赤霉病菌的生长、繁殖和侵染，同时也有利于抗药性群体的发展。 9 结果应用 由省农业主管部门发布小麦赤霉病菌抗药性监测结果，指导全省小麦赤霉病化学防控科学用药。 10 抗性菌株及废弃样本的处理 10.1 将抗性菌株4℃保存于含有PDA培养基的冻存管中，以备复测。 10.2 将分离后的样本烧毁或高温灭菌处理，防止抗药性菌株在检测地点扩散。 附 录 A （规范性） LAMP高通量检测小麦赤霉病菌对多菌灵抗药性 （β2-Tubulin第167位氨基酸突变（F167Y）） A.1 DNA模板制备 用试剂盒将分离的小麦赤霉病菌菌丝体或将含有病原的小麦病粒、或稻桩的子囊壳加入含有CTAB提取液的离心管中，用组织研磨机震荡30 s（28次/s），在12000 rpm离心3 min，吸取上清加入冰冻异丙醇沉淀DNA；12000rpm离心3min，弃上清；用70%的乙醇漂洗1次，12000rpm离心3min，弃上清，风干后加无菌水溶解基因组DNA，备用。 A.2 检测引物 F3: TTCCAGCTGACGCACTCT B3: ACAGAAGGTCTCGTCAGAGT FIP: TGCGATCGGGGAACTCCTCG-TGGTACCGGTTCCGGTATG BIP: AAACCGTTATGCCCTCGCCC-ACGAGCTGGTTCAGAGACAA A.3 反应体系与条件（10 μL） Bst DNA聚合酶（8U/μL）0.3 μL；10×ThermoPol 1.0 μL；MgCl2（25mM） 1.6 μL；dNTP（10 mM） 1.0 μL；FIP（40 μM） 0.4 μL；BIP（40 μM）0.4 μL；F3（10 μM） 0.2 μL；B3（10 μM） 0.2 μL；甜菜碱（8 M） 1.2 μL；HNB（2.5 mM） 0.6 μL；基因组DNA 0.5 μL；dH2O（灭菌蒸馏水） 2.6 μL。反应参数：63℃ 60 min，80℃ 10 min。 按照上述反应体系在恒温水浴锅中63℃反应60 min，80℃ 10 min终止反应，对上述LAMP扩增产物观察其颜色变化，鉴定是否为多菌灵中抗的禾谷镰孢菌菌株；如果LAMP扩增产物显示天蓝色，判定为多菌灵中抗（F167Y）的禾谷镰孢菌菌株；如果扩增产物为紫色，判定为敏感菌株。 __________________________