SNT 2531-2010 贝类和水样中札如病毒检测方法 普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 贝类和水样中札如病毒检测方法普通犚 犜 犘 犆 犚方法和实时荧光犚 犜 犘 犆 犚方法犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犛 犪 狆 狅 狏 犻 狉 狌 狊 犻 狀狊 犺 犲 犾 犾 犳 犻 狊 犺犪 狀 犱狑 犪 狋 犲 狉犆 狅 狀 狏 犲 狀 狋 犻 狅 狀 犪 犾犚 犜 犘 犆 犚犪 狀 犱狉 犲 犪 犾 狋 犻 犿 犲犚 犜 犘 犆 犚 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准附录 为规范性附录，附录为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：潘良文、卢钟山、邓恬宁、吕蓉、张舒亚、李想、刘月明、高琴。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛 犖犜 贝类和水样中札如病毒检测方法普通犚 犜 犘 犆 犚方法和实时荧光犚 犜 犘 犆 犚方法范围本标准规定了贝类和水样中札如病毒普通 方法和实时荧光 方法。本标准适用于贝类和水样中札如病毒的定性检测。规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。基因检验实验室技术要求术语和定义下列术语和定义适用于本标准。犆 狋值 犮 狔 犮 犾 犲 狋 犺 狉 犲 狊 犺 狅 犾 犱每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。质粒标准分子狆 犾 犪 狊 犿 犻 犱狉 犲 犳 犲 狉 犲 狀 犮 犲犿 狅 犾 犲 犮 狌 犾 犲一种包含病毒特异性 片段的重组质粒分子，可作为病毒 检测中的阳性对照。方法提要用合适的裂解液（如 ）提取贝类样品中病毒 ，并根据札如病毒 末端含有 （）的结构，用连接 （）的磁珠特异性吸附札如病毒 进行纯化。对水样中的病毒进行富集后，采用合适的方法提取和纯化病毒 。利用普通 或实时荧光 方法进行检测。本研究通过构建质粒标准分子（每个质粒分子包含拷贝扩增片段），确定札如病毒普通 体系检测下限为 拷贝，实时荧光 体系检测下限均为 拷贝。试剂所有实验用试剂均为分析纯；除特别说明外，实验用水为蒸馏水或去离子水。阳性标本：札如病毒，冰箱保存；或含札如病毒检测目的片段的质粒标准分子，冰箱保存。甘氨酸缓冲液：见附录 。溶液：见附录 。裂解液：或其他等效裂解液（如：）。（）磁珠：（）或等效品。超纯水（无 和 污染）：见附录 。乙醇：见附录 。犛 犖犜 三氯甲烷。异丙醇。吸附缓冲液：见附录 。吸附缓冲液：见附录 。漂洗缓冲液：见附录 。（），。犜 犪 狇（）及配套 荧光校正试剂（），。引物和探针：根据表和表的序列合成引物和探针，加超纯水（无 和 污染）配制成 储备液。表札如病毒普通 犚 犜 犘 犆 犚检测引物名称序列扩增片段大小 注：；：；：；：；：；：。表札如病毒实时荧光 犚 犜 犘 犆 犚检测引物和探针引物和探针名称序列引物 探针 注：；：；：。注：探针也可选用具有与 和 荧光基团相同检测效果的其他合适的荧光报告基团和荧光淬灭基团组合。相对分子质量标记：（显示条带范围 ）或其他具有相近 条带显示范围的相对分子质量标记。缓冲液：见附录 。溴化乙锭（）溶液（）：见附录 。含 溴化乙锭（）的 琼脂糖凝胶：见附录 。加样缓冲液：见附录 。，：见附录 。仪器 实时荧光 仪。仪。电泳仪。凝胶成像分析系统。冷冻离心机。犛 犖犜 w w w.b z f x w.c o m 匀浆器。恒温孵育器。振荡器。微量加样器：、和。高压灭菌锅。生物安全柜。冰箱，冰箱。无 和 污染的玻璃容器：见 。无 和 污染的离心管（、），无 和 污染的移液器吸嘴（、），无 和 污染的药匙，无 和 污染的 扩增反应管：见 。磁性抽提架。已灭菌直径为，孔径为 的乙酸硝酸混合纤维素滤膜 密理博（上海）贸易有限公司，及配套过滤器。无菌一次性 针管。聚乙烯薄膜袋：自封袋，使用前紫外杀菌 。检测方法 实验室要求实验室设施应达到 实验室技术要求。样品制备和札如病毒 犚 犖 犃提取 贝类样品中札如病毒 犚 犖 犃提取 小心切开贝类样品组织，解剖取下贝类的肠腺组织。取左右中肠腺组织加入 甘氨酸缓冲液。使用匀浆器高速匀浆 ，使肠腺组织完全被打碎并与缓冲液混合均匀，将匀浆液装入 离心管，或室温振荡 。将样品匀浆液于，犵离心 。移取上清液至一新的 离心管，加入等体积的 溶液，颠倒混匀次。冰上放置至少后，犵离心 ，弃尽上清液，保留沉淀。向沉淀中加入 裂解液，剧烈振荡，室温放置 。转移溶液至一 离心管，加入 三氯甲烷，剧烈振荡，室温放置 ，犵离心 ，吸取上清液至另一 离心管。向上清液中加入 倍体积（约 ）异丙醇，颠倒混匀后，室温放置 ，犵离心 。弃尽上清液，用，预冷的 乙醇洗涤沉淀。重复步骤 两次，最后一次弃尽上清液。沉淀重悬于 超纯水（无 和 污染）中，将悬液转移至一 离心管中。加入 吸附缓冲液，振荡，放置 。加入 （）磁珠，轻柔混合，磁性抽提架上放置 。弃尽上清液，加入 吸附缓冲液，室温下晃动 洗涤。离心管在磁性抽提架上放置 ，弃尽上清液。加入 漂洗缓冲液，颠倒混匀次，离心管在磁性抽提架上放置 ，弃去上清液。犛 犖犜 w w w.b z f x w.c o m 重复步骤 三次。沉淀用 超纯水（无 和 污染）悬浮，放置 释放。离心管在磁性抽提架上放置 。将上清液移至另一 离心管中，可即吸取进行 检测。水样中札如病毒 犚 犖 犃提取）（使用犙 犻 犪 犵 犲 狀公司犙 犐 犃 犪 犿 狆犞 犻 狉 犪 犾犚 犖 犃 犕 犻 狀 犻犓 犻 狋）用 针管分次取 水样过一直径为，孔径为 的乙酸硝酸混合纤维素滤膜，小心取出滤膜，平整放于聚乙烯薄膜袋中。向薄膜袋中加入 混合液，使滤膜充分浸于缓冲液中，剧烈振荡 ，室温浸泡滤膜 后，小心将液体完全转移到 离心管中。（可选步骤）若回收液体中存在明显可见的固体物质，犵离心 ，转移上清液至一新 离心管中。加入 无水乙醇，剧烈振荡，犵离心 收集液体。将上述液体 转移至带有 收集管的离心柱中，犵离心 ，弃收集管中液体。重复步骤 ，直至所有混合液均通过离心柱，最后一次离心后将离心柱放入一新 收集管中。加入 ，犵离心 ，将离心柱放入一新 收集管中。加入 ，犵离心 。将离心柱放入一新 收集管中，犵离心 以彻底除去残余在离心柱膜上液体。将离心柱放入一新 离心管中，小心的在离心柱膜中央加入 ，室温放置 ，犵离心 。离心管中的液体即为提取的病毒 样品，可即吸取进行 检测。犚 犜 犘 犆 犚检测 普通 犚 犜 犘 犆 犚 普通 犚 犜 犘 犆 犚反应体系病毒 逆转录为 的反应体系见表，反应体系见表。反应体系中各试剂的量可根据不同试剂盒进行适当调整。每个反应体系设置两个平行反应。以札如病毒 或含札如病毒检测目的片段的质粒标准分子 作为阳性对照模板，以不含有札如病毒 或札如病毒检测目的片段的质粒标准分子 的样品作为阴性对照模板，以水代替 模板作为空白对照。）水样中病毒 的提取方法是针对 ，给出的，给出这一信息是为了方便本标准使用者，并不表示只认可该产品，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用等效产品。）该反应体系针对 （），给出，给出这一信息是为了方便本标准使用者，并不表示只认可该产品，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用等效产品。表病毒 犚 犖 犃逆转录反应体系）名称储液浓度终浓度使用量逆转录反应缓冲液 氯化镁（）各 各 抑制剂 逆转录酶 随机引物 犛 犖犜 w w w.b z f x w.c o m表（续）名称储液浓度终浓度使用量 模板 超纯水（无 和 污染）总体积 表札如病毒普通犘 犆 犚反应体系）名称储液浓度终浓度使用量 反应缓冲液氯化镁（）引物 引物 犜 犪 狇 聚合酶 超纯水（无 和 污染）总体积 普通 犚 犜 犘 犆 犚反应参数）病毒 逆转录为 的反应参数：，；，；，；，；普通 反应参数：，；，个循环；，。犘 犆 犚产物的琼脂糖凝胶电泳检测将适量 稀释成 溶液，配制溴化乙锭含量为 的 琼脂糖凝胶。取 产物，加 上样缓冲液点样进行电泳，并在其中一孔道加入 分子量标记以判断 产物的片段大小。电压大小根据电泳槽长度来确定，一般控制在 ，当溴酚蓝移动到凝胶边缘时关闭电源，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录。普通 犚 犜 犘 犆 犚检测下限札如病毒的普通 体系检测下限为 拷贝质粒标准分子。实时荧光 犚 犜 犘 犆 犚 实时荧光犚 犜 犘 犆 犚反应体系病毒 逆转录为 的反应体系见表，反应体系见表。每个反应体系设置两个平行反应。以札如病毒 或含札如病毒检测目的片段的质粒标准分子 作为阳性对照模板，以不含有札如病毒 或札如病毒检测目的片段的质粒标准分子 的样品作为阴性对照模板，以水代替 模板作为空白对照。）反应参数可根据不同型号 仪及 反应体系作适当调整。）该反应体系针对 （），给出，给出这一信息是为了方便本标准使用者，并不表示只认可该产品，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用等效产品。犛 犖犜 w w w.b z f x w.c o m表札如病毒实时荧光犘 犆 犚反应体系）名称储液浓度终浓度加样量 犜 犪 狇（）荧光校正试剂 超纯水（无 和 污染）总体积 该试剂只在具有 荧光校正通道的实时荧光 仪上进行扩增时添加，否则用水补齐。）该反应体系针对 犜 犪 狇（）及配套 荧光校正试剂（），给出，给出这一信息是为了方便本标准使用者，并不表示只认可该产品，如果其他等效产品具有相同的效果。则可使用等效产品。）反应参数可根据不同型号 仪及 反应体系作适当调整。实时荧光 犚 犜 犘 犆 犚反应参数）病毒 逆转录为 的反应参数：，；，；，；，；实时荧光 反应参数：，；，个循环。实时荧光 犚 犜 犘 犆 犚检测下限札如病毒实时荧光 体系检测下限为 拷贝质粒标准分子 。结果判断及表述 结果判定 普通 犚 犜 犘 犆 犚）阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现 的目的扩增条带则表明反应体系运行正常，否则需重新进行普通 扩增；）对样品进行普通 检测，如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现 的扩增条带，而样品未出现扩增条带，则可判定样品未检出札如病毒；）如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照和样品出现 的扩增条带，对 产物进行测序分析比对，产物核酸序列与相应的札如病毒 序列相一致，则可判定样品检出札如病毒。也可采用本标准中实时荧光 的方法进行确证。实时荧光 犚 犜 犘 犆 犚阴性对照和空白对照无荧光增幅现象，阳性对照有荧光增幅现象则表明反应体系运行正常，否则需重新进行实时荧光 扩增：）若待检测样品无荧光增幅现象，则判定样品未检出札如病毒；）若待检测样品有荧光增幅现象，且 值 时，则可判定样品检出札如病毒；犛 犖犜 ）若待检测样品 值介于 和 之间时，应重新进行实时荧光 检测。重新检测后设定同一域值条件下，若 值 时，则可判定样品未检出札如病毒。重新检测后的 值仍介于 和 之间，则判定样品中含有札如病毒。结果表述 根据 描述判定检出札如病毒，则表述为检出札如病毒或札如病毒阳性。根据 描述判定未检出札如病毒，则表述为未检出札如病毒或札如病毒阴性。犛 犖犜 附录犃（规范性附录）溶液的配制犃 普通溶液的配制犃 甘氨酸缓冲液：含 犿 狅 犾犔甘氨酸，犿 狅 犾犔氯化钠（犖 犪 犆 犾），狆 犎 甘氨酸 氯化钠 双蒸水 氢氧化钠溶液调 至 加双蒸水至 ，灭菌备用。犃 犘 犈 犌 溶液：含（质量浓度）犘 犈 犌 ，犿 狅 犾犔氯化钠 氯化钠 加双蒸水至 ，灭菌备用。犃 犜 犃 犈缓冲液犃 犿 狅 犾犔犈 犇 犜 犃 犖 犪 犎犗（二水乙二铵四乙酸钠）溶液，狆 犎 灭菌双蒸水 氢氧化钠溶液调 至 灭菌双蒸水加至 ，灭菌备用。犃 犜 犃 犈电泳缓冲液（）羟基甲基氨基甲烷（）冰乙酸 溶液，灭菌双蒸水加至 ，灭菌备用。使用时用灭菌双蒸