SNT 2754.11-2011 出口食品中致病菌环介导恒温扩增(LAMP)检测方法 第11部分：产霍乱毒素的霍乱弧菌.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 出口食品中致病菌环介导恒温扩增（犔 犃犕犘）检测方法第 部分：产霍乱毒素的霍乱弧菌犔 狅 狅 狆 犿 犲 犱 犻 犪 狋 犲 犱 犻 狊 狅 狋 犺 犲 狉 犿 犪 犾 犪 犿 狆 犾 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀犱 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀犿 犲 狋 犺 狅 犱犳 狅 狉狆 犪 狋 犺 狅 犵 犲 狀 狊犻 狀犲 狓 狆 狅 狉 狋 犳 狅 狅 犱犘 犪 狉 狋 ：犆 犺 狅 犾 犲 狉 犪 狋 狅 狓 犻 狀 狆 狉 狅 犱 狌 犮 犻 狀 犵犞 犻 犫 狉 犻 狅犮 犺 狅 犾 犲 狉 犪 犲 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言 出口食品中致病菌环介导恒温扩增（）检测方法 共分为 个部分：第部分：金黄色葡萄球菌；第部分：大肠杆菌 ；第部分：志贺氏菌；第部分：单核细胞增生李斯特菌；第部分：副溶血性弧菌；第部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌；第部分：空肠弯曲菌；第部分：肺炎克雷伯氏菌；第部分：溶血性链球菌；第 部分：产气荚膜梭菌；第 部分：产霍乱毒素的霍乱弧菌；第 部分：溶藻弧菌；第 部分：创伤弧菌；第 部分：假结核耶尔森氏菌；第 部分：阪崎肠杆菌。本部分为 的第 部分。本部分按照 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏盐城出入境检验检疫局、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、广州华峰生物科技有限公司。本部分主要起草人：曾静、魏海燕、张西萌、王志强、冯家望、李志勇、郑晶、郑文杰、徐帮兴、易敏英、罗雁非、曹以诚、高东微。犛 犖犜 出口食品中致病菌环介导恒温扩增（犔 犃犕犘）检测方法第 部分：产霍乱毒素的霍乱弧菌范围 的本 部 分 规 定 了 检 测 出 口 食 品 中 产 霍 乱 毒 素 霍 乱 弧 菌 的 环 介 导 恒 温 核 酸 扩 增（）法。本部分适用于出口食品中产霍乱毒素的霍乱弧菌的筛选检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。分析实验室用水规格和试验方法 实验室生物安全通用要求 实验室质量控制规范食品分子生物学检测 出口食品中霍乱弧菌检验方法生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测霍乱弧菌，所有培养物和废弃物应按照 中的有关规定执行。防污染措施防止污染措施应符合 的规定。缩略语下列缩略语适用于本文件。：甜菜碱犅 狊 狋酶犅 狊 狋 （）：犅 狊 狋 聚合酶（大片段）：（）：霍乱毒素犮 狋 狓（）：霍乱毒素 亚单位基因（）：脱氧核糖核酸 （）：脱氧核苷三磷酸 （）：乙二胺四乙酸（）：环介导恒温扩增犛 犖犜 ：聚乙二醇辛基苯基醚技术概要根据霍乱弧菌属特有的靶序列犮 狋 狓基因（参见附录）设计特异性内引物、外引物和环状引物各一对，特异性识别靶序列上的八个独立区域，利用犅 狊 狋酶启动循环链置换反应，在犮 狋 狓 基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎 环 混合物；从 析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的 结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。试剂和材料除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合 中一级水的要求。引物：根据霍乱弧菌属特有的靶序列犮 狋 狓基因设计一套特异性引物，包括外引物，外引物，内引物，内引物和环状引物，环状引物。外引物扩增片段长度：。外引物（，）：外引物（，）：内引物（，）：内引物（，）：环状引物（，）：环状引物（，）：提取液：含 （）、和 。：。犅 狊 狋酶：。缓冲液：含 （）、硫酸铵、氯化钾、硫酸镁、。硫酸镁：。甜菜碱：。显色液：荧光染料，。阳性对照：霍乱弧菌标准菌株，或含目的片段的 亦可。塑料离心管。仪器和设备 移液器：量程 ；量程 ；量程 。高速台式离心机：犵。水浴锅或加热模块：和 。计时器。检测程序食品中产霍乱毒素的霍乱弧菌 检测程序见图。犛 犖犜 图食品中产霍乱毒素的霍乱弧菌犔 犃犕犘检测程序 操作步骤 样品制备、增菌培养按照 中方法进行样品制备和增菌。细菌模板犇 犖 犃的制备）增菌液模块犇 犖 犃的制备）采用下述方法，也可使用等效的商品化的 提取试剂盒，并按其说明提取制备模板。对于 获得的增菌液，采用如下方法制备模板 ：）取增菌液加到 无菌离心管中，犵离心 ，尽量吸弃上清液；）加入 提取液，混匀后沸水浴 ，置冰上 ；）于 犵离心 ，上清液即为模板；取上清液置 可保存个月备用。可疑菌落模板犇 犖 犃的制备对于 分离到的可疑菌落，可直接挑取可疑菌落，再按照 ）步骤制备模板 以待检测。环介导恒温核酸扩增 反应体系产霍乱毒素的霍乱弧菌 反应体系见表。犛 犖犜 表产霍乱毒素的霍乱弧菌犔 犃犕犘反应体系组分工作液浓度加样量反应体系终浓度 缓冲液 外侧上游引物（）外侧下游引物（）内侧上游引物（）内侧下游引物（）环状上游引物（）环状下游引物（）甜菜碱 硫酸镁 犅 狊 狋 聚合酶 模板去离子水 反应过程 按表所述配制反应体系。恒温扩增 ，使酶失活，反应即结束。空白对照、阴性对照、阳性对照设置每次反应应设置阴性对照、空白对照和阳性对照。空白对照以水代替 模板。阴性对照以 提取液代替 模板。阳性对照制备：将霍乱弧菌标准菌株接种于氯化钠碱性蛋白胨水（）中 培养 ，用无菌生理盐水稀释至约 （约麦氏浊度），按 提取模板 作为 反应的模板。结果观察在上述反应管中加入显色液，轻轻混匀并在黑色背景下观察。结果判定和报告在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：）待检样品反应管液体呈绿色，该样品结果为霍乱弧菌初筛阳性，对样品的增菌液或可疑纯菌落进一步按 中操作步骤进行确认后报告结果；）待检样品反应管液体呈橙色，则可报告霍乱弧菌检验结果为阴性。若与上述条件不符，则本次检测结果无效，应更换试剂按本方法重新检测。犛 犖犜 附录犃（资料性附录）产霍乱毒素的霍乱菌犮 狋 狓犃基因序列（部分）及引物设计示意图（犪 犮 犮 犲 狊 狊 犻 狅 狀狀 狅 犓 ）（）：（）：（）：（）：（）：（）：注：下划线标注序列为产霍乱毒素的霍乱弧菌 引物设计所选取的个区域，黑色字体为 引物所用到的序列。和 分别是外侧上游引物和外侧下游引物；和 分别是内侧上游引物和内侧下游引物；和 是环状上游引物和环状下游引物。犛 犖犜