SNT 1559-2010 非洲猪瘟检疫技术规范.pdf

SN/T1559-20105.2.5接种每份组织上清液接种3管/孔白细胞培养物，每管接种0.2mL或每孔加入20L。如果样品保存不好，做10倍或100倍稀释后再接种到培养物。用工作浓度的非洲猪瘟标准毒株接种1管白细胞培养物，作阳性对照。另留1管白细胞培养物不接种病毒，作阴性对照。5.2.6加红细胞37培养3d后，每管加人0.2 mL PBS新鲜配制的1%猪红细胞，继续培养于37。如果是96孔培养板，培养1d之后加20L新鲜配制的1%猪红细胞。5.2.7镜检每天用显微镜或倒置显微镜检查细胞病变(CPE)和红细胞吸附情况，连续检查7d10d。5.2.8结果判定将培养物轻轻摇动，置于低倍镜下(10)观察。阳性对照的白细胞表面有大量猪红细胞附着，形成玫瑰花环或桑葚体状；而阴性对照的白细胞无红细胞附着，则对照成立，可进行结果判定。在无红细胞吸附的情况下发生的贴壁细胞数量减少的CPE是由于接种物的细胞毒性引起，伪狂犬病或无血细胞吸附作用的ASFV可用细胞沉淀物做FAT或用PCR来检测。如果没有观察到变化，或FAT和PCR试验阴性，宜将上清液接种新鲜培养物再传3代。所有的分离培养物都应该用PCR试验和测序确诊。6病毒荧光抗体试验(FAT)6.1仪器设备6.1.1冷冻切片机。6.1.2恒温培养箱。6.1.3荧光显微镜。6.1.4冰箱。6.2试验材料6.2.1非洲猪瘟标准毒株。6.2.2异硫氰酸荧光素标记的非洲猪瘟抗体。6.2.3蒸馏水：用盐酸或氢氧化钠调整蒸馏水的PH值至7.4。6.2.40.01mol/LpH7.4PBS(磷酸缓冲溶液)，配制方法见附录B。6.2.5丙酮：使用前置冰箱预冷。6.2.6待检样品：无菌采取可疑病猪的脾脏、扁桃体、淋巴结，置于尽可能的低温但不冷冻的容器内运送和保存。待检样品也可以是已经接种的白细胞培养物。6.3操作方法6.3.1待检组织的制备6.3.1.1组织切片、印片或涂片将待检组织制成厚度为4m7m的冰冻切片，也可制成印片或涂片。6.3.1.2白细胞培养物涂片用已接种待检组织的白细胞培养物涂片，制成待检标本。用阳性对照管的细胞培养物涂片，制成阳性对照标本。用阴性对照管的细胞培养物涂片，制成阴性对照标本。6.3.2固定分别将上述标本在室温下自然风干，用预冷丙酮固定10min。6.3.3加荧光抗体在标本上滴加预先滴定浓度的异硫氰酸荧光素标记的ASV抗体染色，然后将标本放入湿盒内，置于37恒温培养箱内着染1h。阳性和阴性对照样品同时进行固定和染色。3