SNT 2653-2010 木瓜中转基因成分定性PCR检测方法.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准?木瓜中转基因成分定性?检测方法?发布?实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：陈红运、陈双雅、梁新苗、康林、叶正清、李玲、朱水芳、陈洪俊。犛 犖犜 木瓜中转基因成分定性犘 犆 犚检测方法范围本标准规定了木瓜中转基因成分的定性 检测方法。本标准适用于抗病毒转基因木瓜的定性检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。分析实验室用水规格和实验方法 基因检验实验室技术要求 植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法缩略语下列缩略语适用于本文件。（）：外壳蛋白基因 （）：来自于花椰菜花叶病毒的 启动子：株系 基因介导的抗病毒转基因木瓜品系 （）：新霉素 磷酸转移酶基因（）：胭脂碱合成酶基因终止子 （）：木瓜环斑病毒 ：木瓜蛋白酶基因，木瓜内源基因 （）：复制酶基因 ：株系 基因介导的抗病毒转基因木瓜品系华农号：基因介导的抗病毒转基因木瓜品系原理样品经过提取 后，针对转基因植物所插入的外源基因的基因序列设计引物，通过 技术，特异性扩增外源基因的 片断，根据 扩增结果，判断该样品中是否含有转基因成分。试剂和仪器 试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。水为 规定的一级水。缓冲液（）：称取 ，溶于 水中，搅拌，加入浓盐酸 ，冷却至室温，用稀盐酸准确调整 至，然后定容至，分装后高压灭菌备用。犛 犖犜 （）：在 水中加入 ，在磁力搅拌器剧烈搅拌，用氢氧化钠调节溶液 值至（约需 氢氧化钠颗粒），然后定容至。分装后高压灭菌备用。提取缓冲液：量取 ，称取 十二烷基碳酸钠（），氯化钠，定容至，分装灭菌备用。酶（）。聚乙烯吡咯烷酮（）。饱和酚。三氯甲烷。异戊醇。异丙醇。乙醇。缓冲液：分别加入 （）和 （）溶液，定容至。在 （）条件下灭菌 。犜 犪 狇 聚合酶。：、。缓冲液：，硼酸 ，（），定容至。琼脂糖（电泳纯）。分子量标记（）。溴化乙锭（）或其他染色剂。引物：检测转基因木瓜内、外源基因的引物及其信息见表。表检测转基因木瓜内、外源基因所需的引物信息检测基因来源引物序列（上游下游）扩增长度 提示备注 内源 木瓜内源基因 外源 外源 筛选检测任选其一 外源 外源 筛选检测任选其一 外源 筛选检测 外源 （）检测 检测 外源 检测华农号犛 犖犜 仪器匀浆机或冷冻研磨机；高速冷冻离心机，台式小型离心机，个人离心机；恒温水浴；天平（感量 ）；高压灭菌锅；高温干燥箱；纯水器，双蒸水器；冷藏、冷冻冰箱；制冰机；旋涡振荡器；微波炉；基因扩增仪；电泳仪；超净工作台；核酸蛋白分析仪；微量移液器；凝胶成像系统；离心管（）：反应管（规格）或 孔 反应板。抽样和制样 抽样按照 中规定的方法执行。制样 木瓜种子经干热灭菌（干热预处理）或 、高压消毒处理的碾钵或粉碎机中碾磨至样品粉末颗粒约 左右大小。新鲜木瓜称取 果肉充分匀浆后备用，或者取出种子后冷冻研磨至样品粉末颗粒约 左右大小。检测 防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照 中的规定执行。模板犇 犖 犃提取木瓜种子：将 研磨的粉末分装于 的离心管中，加入 预热的提取缓冲液，再加入 的 ，混匀，保温 ，期间摇动数次。加入等体积的酚三氯甲烷，轻轻颠倒混匀。犵离心 。取上清液，加入三分之二倍体积的冰冷的异丙醇，混匀。犵离心 。去掉 上 清 液 中 的 异 丙 醇，此 时 管 底 有 白 色 沉 淀。向 白 色 沉 淀 中 加 入 的 酶（），保温 。加入 乙酸钾（）。于 犵离心 。去掉上清液，保留沉淀。用 乙醇洗涤沉淀次，干燥。用 溶解沉淀，作为 反应的模板，保存备用。也可用市售试剂盒提取。木瓜果肉：建议用市售试剂盒提取，例如使用含有硅基质材料的离心柱可有效去除植物组织中多糖、酚复合物和酶抑制剂。犘 犆 犚扩增 犘 犆 犚反应体系检测转基因木瓜中内、外源基因的 反应体系见表。以转基因木瓜 或已知相应阳性质粒作为阳性对照，非转基因木瓜 作为阴性对照，以代替模板 作为空白对照。犛 犖犜 表转基因木瓜内、外源基因检测的犘 犆 犚反应体系试剂名称储备液浓度 体系中加样体积 体系中加样体积 缓冲液 氯化镁 引物 模板 犜 犪 狇 聚合酶 双蒸水补至 补至 注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。注：每个反应体系应设置两个平行反应。犘 犆 犚反应循环参数 预变性 。变性 ，退火，延伸，个循环。延伸 。保存。也可根据不同的基因扩增仪对 反应循环参数做适当调整。犘 犆 犚扩增产物电泳检测用电泳缓冲液（或 ）制备琼脂糖凝胶（其中在 左右加入 至终浓度为，也可在电泳后进行染色）。将 扩增产物分别和上样缓冲液混合，进行点样。用 或相应合适的 作相对分子质量标记。恒压，电泳 。凝胶成像仪观察并分析记录。结果判断 内源基因的检测用针对木瓜内源的 基因设计的引物对木瓜 提取液进行 测试，阴性对照、阳性对照和待测样品均应被扩增出 的 产物。如未见有该 产物扩增，则说明 提取质量有问题，或 提取液中有抑制 反应的因子存在，应重新提取，直到扩增出该 产物。外源基因的检测对木瓜样品 提取液进行外源基因的 测试，如果阴性对照和空白对照未出现扩增条带，阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条带（扩增片段大小见表），则可判定待测样品中含有该外源基因；如果待测样品中未出现 扩增产物，则可断定待测样品中不含有该外源基因。筛选检测和鉴定检测的选择对木瓜样品中转基因成分的检测，先筛选检测 、和 基因，筛选检测结果阴性则直接报告结果。犛 犖犜 若筛选检测结果阳性，则需进一步鉴定检测 和 基因，以确定是何种转基因木瓜品系。结果表述 未检出基因。检出基因，（可进一步报告）该检测样品是转基因木瓜品系。犛 犖犜