SNT 2677-2010 进出口动物源性食品中雄性激素类药物残留量检测方法 液相色谱-质谱质谱法.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 进出口动物源性食品中雄性激素类药物残留量检测方法液相色谱 质谱 质谱法犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犪 狀 犱 狉 狅 犵 犲 狀狉 犲 狊 犻 犱 狌 犲 狊 犻 狀犳 狅 狅 犱 狊 狋 狌 犳 犳 狊狅 犳犪 狀 犻 犿 犪 犾 狅 狉 犻 犵 犻 狀犳 狅 狉 犻 犿 狆 狅 狉 狋 犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋犔 犆 犕 犛犕 犛犿 犲 狋 犺 狅 犱 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中国检科院。本标准主要起草人：林黎明、张鸿伟、陈亮珍、杜明、孟庆贺、岳振锋、彭涛、庞士平、包大勇。犛 犖犜 进出口动物源性食品中雄性激素类药物残留量检测方法液相色谱 质谱 质谱法范围本标准规定了动物源食品中种雄性激素类药物残留量测定的制样、液相色谱 质谱质谱测定和确证方法。本标准适用于蜂蜜、牛奶、猪肾、猪肝和猪肉中去甲雄三烯醇酮、去氢睾酮、去甲睾酮、睾酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮和表睾酮等七种雄性激素类药物残留量的测定。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。分析实验室用水规格和试验方法方法提要试样经酶解，乙腈提取样品中七种雄性激素类药物残留，固相萃取柱净化，浓缩，液相色谱 质谱质谱测定，内标法定量。试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯；水为 规定的一级水。乙腈，色谱级。正己烷，色谱级。丙酮，色谱级。甲醇，色谱级。正丙醇，色谱级。葡糖苷硫酸酯酶（葡萄糖苷酶：；硫酸酯酶：）。硅藻土。丙酮 水溶液（，体积比）：取丙酮（），水 ，混合后振摇混匀。乙腈饱和的正己烷溶液：取正己烷（）于 分液漏斗中，加入少量乙腈（），剧烈振摇数分钟，静止分层后弃下层乙腈层即得。乙腈 水溶液（，体积比）：取乙腈（），水 ，混合后振荡混匀。固相萃取柱：柱，或相当者，使用前用 甲醇，水活化。固相萃取柱：柱，或相当者，使用前用 乙腈活化。标准物质和内标：去甲雄三烯醇酮、去氢睾酮、去甲睾酮、睾酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、表睾酮犛 犖犜 等标准物质，纯度；睾酮 和脱氢表雄酮 内标物质：纯度。标准溶液：标准储备溶液：分别准确称取适量七种雄性激素相应化合物标准物质（），用甲醇溶解定容至 ，得质量浓度分别为 的标准储备溶液。在 以下，有效期 个月。混合标准中间液：准确吸取各种雄性激素类标准储备液（）适量，用甲醇准确稀释到去甲雄三烯醇酮、去氢睾酮、去甲睾酮、睾酮、雄烯二酮、表睾酮的浓度为 ，脱氢表雄酮的浓度为 ，在 以下，有效期个月。氘代内标储备溶液：分别准确称取适量睾酮 和脱氢表雄酮 标准物质（），用甲醇溶解定容至 ，得质量浓度分别为 的氘代内标储备溶液，在 以下，有效期 个月。混合氘代内标中间溶液：准确吸取种氘代内标储备液（）适量，用甲醇准确稀释到睾酮 的浓度为，脱氢表雄酮 的浓度为 ，在 以下，有效期个月。混合标准工作液：标准工作液根据需要使用前用空白样品基质提取溶液配制，空白样品基质溶液采用相应的无残留基质样品参照 、所述操作步骤操作。该溶液使用前配制。混合氘代内标工作溶液：分别准确吸取混合氘代内标中间液（）适量，用甲醇准确稀释到睾酮 的浓度为，脱氢表雄酮 的浓度为 作为氘代内标工作溶液。该溶液使用前配制。微孔滤膜：。仪器和设备 液相色谱 质谱质谱仪或相当者：配有电喷雾离子源。固相萃取装置。旋涡混合器。高速冷冻离心机：。螺旋盖聚丙烯离心试管，。组织捣碎机。均质器。超声波仪。吹氮浓缩仪。恒温水浴振荡器。样品制备与保存 动物内脏、肌肉从所取全部样品中取出有代表性样品可食部分约 ，用组织捣碎碎机充分捣碎均匀，均分成两份，分别装入洁净容器中，密封，并标明标记，于 以下冷冻存放。牛奶、蜂蜜样品从所取全部样品中取出有代表性样品 ，充分混匀，均分成两份，分别装入洁净容器中，密封，并标明标记，于 以下冷冻存放。在操作过程中，应防止样品污染或发生残留物含量的变化。犛 犖犜 测定步骤 样品提取 动物组织（肝、肾、肌肉等）称取试样（精确到 ），置于 具螺旋盖聚丙烯离心管中，加入 混合氘代内标工作溶液（），放置 ，加入硅藻土（精确到）（）和 乙腈（），在均质器中 均质，加入 葡糖苷硫酸酯酶（），涡旋混匀，振荡温育过夜。放冷至室温，于，离心 ，收集上清液于另一个干净的 玻璃试管中。向离心残渣中再加入乙腈（），涡旋混匀 ，室温超声提取 ，于，离心 ，收集上清液，合并次提取液，氮气流吹干。乙腈（）溶解残渣，加入 乙腈饱和正己烷溶液（），涡旋混匀，转移至 离心管中，于，离心 ，将下层溶液转移至 玻璃试管中，加入 水，混匀，待净化。牛奶和蜂蜜样品称取试样（精确到 ），置于 具螺旋盖聚丙烯离心管中，加入 混合氘代内标添加溶液（），放置 ，加入硅藻土（精确到）（）研磨均匀，加入 乙腈（），涡旋混匀。室温超声提取 ，其余按 相关步骤操作。净化将样品提取液转移至已活化的固相萃取 柱（）中，控制流速不超过 。依次用 水、丙酮 水溶液（）（）和 正己烷（）淋洗柱子，淋洗液完全通过小柱后，抽干小柱，将已活化的固相萃取 柱（）串接到 柱下面，用 乙腈（）洗脱，流速不超过 ，收集洗脱液于 玻璃试管中，氮气流吹干，加入 乙腈 水（）溶解残渣，涡旋，超声 ，过 滤膜，供液相色谱 质谱质谱仪测定。测定 液相色谱条件液相色谱条件如下：）色谱柱：柱，（内径），或相当者；）流动相：乙腈；：甲酸水溶液；：乙酸铵水溶液，梯度洗脱条件见表；表梯度洗脱程序表时间 犛 犖犜 ）流速：；）柱温：；）进样量：。质谱条件质谱条件如下：）离子化模式：电喷雾；）扫描模式：正离子扫描；）检测方式：多反应监测（）；）分辨率：单位分辨率。其他质谱条件参见附录。液相色谱 质谱质谱测定 定性测定每种被测组分选择个母离子，个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间与基质标准溶液该物质的保留时间偏差在之内，且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的基质混合标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度 允许的相对偏差 定量测定根据试样中被测雄性激素类药物残留的含量情况，选取响应值相近的标准工作液一起进行色谱 质谱质谱分析。标准工作液和待测液中七种雄性激素的响应值均应在仪器线性响应范围内。对标准工作液和样液等体积参插进样进行测定。在上述测定条件下各种雄性激素类药物的参考保留时间为去甲雄三烯醇酮：；去氢睾酮：；去甲睾酮：；睾酮：；脱氢表雄酮：；雄烯二酮：；表睾酮：；标准溶液的多反应监测（）色谱图参见附录。空白试验除不加试样外，其余按上述测定步骤进行。结果计算和表述根据种目标化合物保留时间将其分为两组，分别采用种内标进行定量，具体内标分配参见表。按式（）或仪器数据处理系统计算雄性激素类残留含量。计算结果需扣除空白值。犡犮犮犻犃犃犻犞犮犻犃犻犃犿 （）犛 犖犜 式中：犡 试样中待测组分的含量，单位为微克每千克（）；犮 标准工作溶液待测组分的浓度，单位为微克每升（）；犮犻 测试液中内标物的浓度，单位为微克每升（）；犃 测试液中待测组分的峰面积；犃 标准工作溶液中内标物的峰面积；犞 样品定容体积，单位为毫升（）；犮犻 标准工作溶液中内标物的浓度，单位为微克每升（）；犃犻 测试液中内标物的峰面积；犃 标准工作溶液中待测组分的峰面积；犿 最终样液代表的试样质量，单位为克（）。测定低限和回收率 测定低限去甲雄三烯醇酮、去氢睾酮、去甲睾酮、睾酮、雄烯二酮和表睾酮等六种雄性激素均为 ，脱氢表雄酮为 。回收率在不同的基质中，雄性激素各化合物添加回收的试验数据见表。表雄性激素类残留量测定的添加回收率试验数据药物名称添加浓度 回收率蜂蜜牛奶猪肾猪肝猪肉去甲雄三烯醇酮 去氢睾酮 去甲睾酮 睾酮 脱氢表雄酮 犛 犖犜 表（续）药物名称添加浓度 回收率蜂蜜牛奶猪肾猪肝猪肉雄烯二酮 表睾酮 犛 犖犜 附录犃（资料性附录）犃 犘 犐 型质谱质谱仪参考质谱条件）参考质谱条件：）离子喷雾电压：；）气帘气压力：；）雾化气压力：；）辅助气压力：；）离子源温度（）：；）其他质谱参数见表 。表 犃 七种雄性激素及其内标物的主要参考质谱参数组别名称定性离子对（）定量离子对（）去簇电压碰撞能量组去甲雄三烯醇酮 去氢睾酮 去甲睾酮 睾酮 组定量内标睾酮 组脱氢表雄酮 雄烯二酮 表睾酮 组定量内标脱氢表雄酮 ）非商业性声明：附录 所列参数是在 质谱质谱仪上完成的，此处列出的试验用仪器型号仅是为了提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试不同型号的仪器。犛 犖犜 附录犅（资料性附录）标准物质的多反应监测（犕犚犕）色谱图犪）犫）犮）犱）犲）犳）图犅 雄性激素标准物质及氚代内标的多反应监测（犕犚犕）色谱图犛 犖犜 犵）犺）犻）图犅（续）犛 犖犜 犉 狅 狉 狑 犪 狉 犱犜 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱狑 犪 狊狆 狉 狅 狆 狅 狊 犲 犱犫 狔犪 狀 犱 犻 狊狌 狀 犱 犲 狉 狋 犺 犲犮 犺 犪 狉 犵 犲狅 犳犆 犺 犻 狀 犪犖 犪 狋 犻 狅 狀 犪 犾 犚 犲 犵 狌 犾 犪 狋 狅 狉 狔犆 狅 犿犿 犻 狊 狊 犻 狅 狀犳 狅 狉犆 犲 狉 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱犃 犮 犮 狉 犲 犱 犻 狋 犪 狋 犻 狅 狀 犜 犺 犲狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱狑 犪 狊犱 狉 犪 犳 狋 犲 犱犫 狔犛 犺 犪 狀 犱 狅 狀 犵犈 狀 狋 狉 狔 犈 狓 犻 狋 犐 狀 狊 狆 犲 犮 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱犙 狌 犪 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲犅 狌 狉 犲 犪 狌狅 犳 狋 犺 犲犘 犲 狅 狆 犾 犲狊犚 犲 狆 狌 犫 犾 犻 犮狅 犳犆 犺 犻 狀 犪，犛 犺 犲 狀 狕 犺 犲 狀犈 狀 狋 狉 狔 犈 狓 犻 狋 犐 狀 狊 狆 犲 犮 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱犙 狌 犪 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲犅 狌 狉 犲 犪 狌狅 犳 狋 犺 犲犘 犲 狅 狆 犾 犲狊犚 犲 狆 狌 犫 犾 犻 犮狅 犳犆 犺 犻 狀 犪犪 狀 犱犆 犺 犻 狀 犲 狊 犲犃 犮 犪 犱 犲 犿 狔狅 犳 犐 狀 狊 狆 犲 犮 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱犙 狌 犪 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲 犜 犺 犲犿 犪 犻 狀犱 狉 犪 犳 狋 犲 狉 狊狅 犳狋 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱犪 狉 犲犔 犻 狀犔 犻 犿 犻 狀 犵，犣 犺 犪 狀 犵犎 狅 狀 犵 狑 犲 犻，犆 犺 犲 狀犔 犻 犪 狀 犵 狕 犺 犲 狀，犇 狌犕 犻 狀 犵，犕 犲 狀 犵犙 犻 狀 犵 犺 犲，犢 狌 犲犣 犺 犲 狀 犳 犲 狀 犵，犘 犲 狀 犵 狋 犪 狅，犘 犪 狀 犵犛 犺 犻 狆 犻 狀 犵，犅 犪 狅犇 犪 狔 狅 狀 犵 犛 犖犜 犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犪 狀 犱 狉 狅 犵 犲 狀狉 犲 狊 犻 犱 狌 犲 狊 犻 狀犳 狅 狅 犱 狊 狋 狌 犳 犳 狊狅 犳犪 狀 犻 犿 犪 犾 狅 狉 犻 犵 犻 狀犳 狅 狉 犻 犿 狆 狅 狉 狋犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋犔 犆 犕 犛犕 犛犿 犲 狋 犺 狅 犱犛 犮 狅 狆 犲犜 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱狊 狆 犲 犮 犻 犳 犻 犲 狊狋 犺 犲犿 犲 狋 犺 狅 犱 狊狅 犳狊 犪 犿 狆 犾 犲狆 狉 犲 狆 犪 狉 犪 狋 犻 狅 狀，犱 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱犮 狅 狀 犳 犻 狉 犿 犪 狋 犻 狅 狀犫 狔 犾 犻 狇 狌 犻 犱犮 犺 狉 狅 犿 犪 狋 狅 犵 狉 犪 狆 犺 狔