SNT 1375-2004 玉米细菌性枯萎病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T 1 3 7 5-2 0 0 4玉米细菌性枯萎病菌检疫鉴定方法Me t h o d s f o r q u a r a n t i n e a n d i d e n t i f i c a t i o n o fP a n t o e a s t e w a r t i i(S mi t h)Me r g a e r t e t a l.2 0 0 4-0 6-0 1 发布2 0 0 4-1 2-0 1 实施中华人民共和国国家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局S N/T 1 3 7 5-2 0 0 4引言 玉米细菌性枯萎病(S t e w a r t s B a c t e r i a l Wi l t o f C o r n)是玉米上的一种毁灭性的病害，我国尚无该病害发生。该病可以通过带菌种子远距离传播(种传)，在病区则以昆虫传播为主。其病原菌 P a wo e as t e w a r t i i(S m i t h)M e r g a e r t e t a l.，异名:E r w i n i a s t e w a r t i i(S m i t h)D y e，中文名称:斯氏泛菌。在1 9 9 2 年农业部颁布的 中华人民共和国进境植物检疫危险性病、虫、杂草名录 中，被列为一类危险性有害生物。为保护我国农业生产，防止玉米细菌性枯萎病传人我国，做好进境植物检疫工作，规范并正确掌握该病菌的检疫鉴定方法，特制定本标准。S N/T 1 3 7 5-2 0 0 4玉米细菌性枯萎病菌检疫鉴定方法范围本标准规定了进境植物检疫中玉米细菌性枯萎病菌的检疫和鉴定方法。本标准适用于进境种用及其他用途玉米中玉米细菌性枯萎病菌的检疫和鉴定。规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。G B/T 4 7 8 9.2 8-1 9 9 4 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂原理3.1 玉米细菌性枯姜病菌的分类地位 玉米细 菌性枯萎病菌P a n t o e a s t e w a r t i i(S m i t h)Me r g a e r t e t a l.，异名:E r w i n i a s t e w a r t i i(S m i t h)D y e属原核生物总界 P r o c a r y o t a e细菌界 B a c t e r i u m,薄壁菌门G r a c i l i c u t e s,肠杆菌科 E n t e r o b a c t e r i-a c e a e，泛菌属 P a wo e a。为兼性厌氧杆菌，革兰氏阴性，大小为0.4 k m-0.7 p m乘0.9 p m-2.0 gy m,无鞭毛，两端钝圆，单生或以短链形式存在。该病菌在玉米上引发的玉米细菌性枯萎病是一种典型的维管束病害，此病害为种传，带菌种子是其远距离传播的主要因素。32检疫原理 酶联免疫吸附试验(E L I S A)及免疫吸附分离试验利用血清学技术具有特异性强的优点，与常规生理生化鉴定技术协同应用于玉米种子中 P.s t e w a r t i i 的检测、分离和鉴定，具有快速、灵敏、有效且结果准确的特点，适合对玉米种子中尸.s t e wa r t i i 的检疫鉴定。仪器、设备 小型粉碎机、超净工作台、天平、恒温培养箱、高压灭菌锅、生物显微镜、酶标仪、洗板器、酸度计、高速冷冻离心机、可调移液器、聚苯乙烯塑料培养皿等5 药品、试剂、培养墓 检验中所需的药品均为分析纯。5.1 药 品 碳酸钠(N a,C O,),碳 酸氢钠(N a HC O,),磷 酸氢二钠(N a,HP 认。I 2 H _ O),磷 酸二氢钾(K H,P O,),氯化 钠(Na C l),氯化钾(K C ll,氯化钙(C a C l i),吐 温-2 0(T w e e n-2 0),磷 酸氢二 钾(K,HP 认)、硫酸镁(Mg S 认 7 H,0)、双氧水(H,O,)、四甲基联苯胺、二 甲基亚矾、蛋白陈、蔗搪(C Hxx 认;)、抗坏血酸(C s H g 认),A蛋白(S P A),酶标记 A蛋白(HR P-S P A)、升汞(Hg C l)或次氯酸钠(N a O C I),9 5%乙醇(C H,C H,OH)等。5,2 试 剂 革兰氏染色液、鞭毛染色液。53 培养基 改良W氏培养基。制作方法见附录 A。S N/T 1 3 7 5-2 0 0 46 对照菌株和抗血清 阴、阳性对照菌。其中阴性对照菌可选用除 P.s t e wa r t“以外的、不同种的细菌菌株，一般为同属不同种的菌;革兰氏染色中的阴性对照菌为大肠杆菌(E s c h e r i c h i a rol i)。对照菌在应用中需配制成1 0 c f u/mL 浓度的菌悬液。检验 中所需抗体均为同种 P.s t e wa r t i i 抗血清，其使用浓度依其效价而定。7玉米细菌性枯萎病菌 P.s t e w a r t“的检测、分离及鉴定7.1 检验样品的制备 从待检样品中挑选不成熟的、皱缩的、有穗轴的及色泽较深的籽粒作为检验样品。每份检验样品应不少于。.2 5 k g。待检样品在。.2 5 k g以上、1 k g以下的，检验样品可适当减少，但不得低于。.1 2 5 k g.7.2样品的检验:.:检测悬液的制备 样品表面消毒 将检验 样品 用。.1%升汞(H g C U 溶 液进行表面消 毒处理1 m in-2 m in，或用3 写-5%的次抓酸 钠(N a O C I)表面消毒处理 5 min-1 5 mi n，然后无菌水冲洗三次，无菌条件下晾干。对于药剂拌种的种子样品，可用 9 5%乙醇(C H,C HZ OH)洗去表面药剂后，再用无菌水冲洗三次，无菌条件下晾干.7.2.1.2悬液的制备 将表面消毒后的检验样品粉碎，放到三角瓶中，加适量 0.8 5%生理盐水室温浸泡 4h-6h或置于4 冷藏箱中过夜。之后将种子浸泡液移人离心管，在 1 0 0 0 r/mi n 下离心 1 0 min，弃去沉淀，取上清液转人另外离心管，1 0 0 0 0 r/m i n 离心 1 5 m i n，弃去上清液，加 2 mL生理盐水使之悬浮，得到悬液.将悬液分成两份，一份。.5 mL用于 E L I S A检测，另外一份 1.5 mL稀释 1 0 倍用做免疫分离。7.2.2 应用S P A-E L I S A检测 P.s t e w a r t i i7.2.2.1 包被 在酶联板板孔内每孔加人 2 0 0 K L以包被缓冲液稀释的S P A，保湿条件下置于4 0C培养箱中过夜。7.2.2.2 洗涤 用 P B S T洗涤液洗涤三次，每次时间为3 min.7.2.2.3 加第一抗体 向板孔中加注 2 0 0 I L经稀释的第一抗体，保湿条件下置于 3 7 培养箱中孵育2 h.7.2.2.4 洗涤 方法见 7.2.2.2 e7.2.2.5 加检测悬液 向板孔中加注检测悬液，每孔 2 0 0 f L，同时设阴、阳性及空白对照(空白对照用生理盐水);保湿条件下置于 3 7 培养箱中孵育3 h,7.2.2.6 洗涤 方法见7.2.2.2,7.2.2.7 加第二抗体 向板孔中加注 2 0 0 j L经稀释的第二抗体，保湿条件下置于 3 7 0C培养箱中孵育2 h,7.2.2.8 洗涤 方 法见7.2.2.2,7.2.2.9 加酶标记 A蛋白 向板孔中加注 2 0 0 p L经稀释的酶标记A蛋白，保湿条件下置于3 7 C培养箱中孵育 2 h,zS N/T 1 3 7 5-2 0 0 47.2.2.1 0洗涤 方法见 7.2.2.2.7.2.2.1 1 加底物反应液 向板孔中加注 1 0 0 ft L底物反应液，黑暗条件下反应 2 0 mi n左右，直至阳性对照孔显出明显的颜色。7.2.2.1 2 终止反应 向板孔中加注 1 0 0 P L 2 m o l/L硫酸终止颜色反应。7.2.2.1 3读数 在酶标仪上以4 9 0 n m波长测定各孔的OD值，读数前以空白孔调整为。7.2.2.1 4 S PA-E LI S A结果 判定 将样品孔和阴性对照孔的读数进行比较，如果样品孔与阴性孔的0工 比值大于 2，则检测结果判定为阳性，样品中可能带有玉米细菌性枯萎病菌P.s t e w a r t i i，需进行下一步 7.3 病菌的分离和鉴定工作;否则，判定最终检测结果为阴性，样品中不带有玉米细菌性枯萎病菌 P.s t e w a r t i i,7.3 病菌的分离和鉴定7.3.1 病菌的免疫分离7.3.1.1 抗血清包被 在聚苯乙烯培养皿底部反面用记号笔划出五个直径为 1.5 c m的圆形区域作为标本区域，然后再在培养皿中的每个标本区域内，加以包被缓冲液稀释的玉米细菌性枯萎病菌抗血清 3 0 0 p L,涂满整个区域。培养皿加盖儿于湿盒内，3 7 C孵育 3 h-4 h 或在 4 冰箱中过夜。7.3.1.2洗涤 取出培养皿，用R T液冲洗五次，之后在培养皿内加 R T P液覆盖整个培养皿的底部，3 7 恒温箱中孵育 1 h.7.3.1.3 加菌悬液 除去 R T P液，向培养皿中加 7.2.1.2制备的菌悬液，悬液应覆盖整个培养皿的底部，培养皿加盖儿置于湿盒内，在 3 7 恒温箱中孵育 1h 或在 4 冰箱中过夜。同时设阴、阳性及空白对照(空白对照用生理盐水)。7.3.1.4 洗涤 取出培养皿，用 R T液冲洗五次，期间间隔浸泡 2 m i n,7.3.1.5 倒培养基 除去残留的R T液，向培养皿中倒入 4 0 0C-5 0 的改良W 氏培养基，能够覆盖整个培养皿的底部即可。7.3.1.6 病菌的培养 将培养皿放人3 0 C 恒温箱中培养，定时观察菌落的出现情况。从中挑取淡黄色或黄色的、稍隆起、油质状、边缘整齐、生长迅速、半透明且有较大粘性的菌落转接至另外改良W 氏培养基平板上，3 0 培养，最终获得具有上述特征的、单一菌落形态的分离菌。7.3.2 分离菌的鉴定7.3.2.1 革兰氏染色 按 G B/T 4 7 8 9.2 8-1 9 9 4 中 2.2 规定的方法进行。如果染色结果为革兰氏阴性菌，则继续进行下一步 7.3.2.2鞭毛染色工作;如若染色结果为革兰氏阳 性菌，则判定最终鉴定结果为检验样品中 不带有玉米细菌性枯萎病菌P.s t e w a r t i i,7.3.2.2 鞭毛染色 按G B/T 4 7 8 9.2 8-1 9 9 4 中2.7 规定的方法进行。如果分离菌经镜检发现无鞭毛，则继续进行下一步 7.3.2.3分离菌的生理生化测定工作;如若发现S N/T 1 3 7 5-2 0 0 4有鞭毛，则判定最终鉴定结果为检验样品中不带有玉米细菌性枯萎病菌P.s t e w a r t i i,7.3.2.3 生理生化测定 玉米细菌性枯萎病菌P a n t o e a s t e w a r t i i 的生理生化特征见附录 B,如分离菌的生理生化测定结果与P a n t o e a s t e w a r t i i 的生理生化特征相符合，可据此判定最终鉴定结果为阳性，该分离菌为 P.s t e w a r t i i，样品中带有玉米细菌性枯萎病菌P.s t e w a r t i i;如不符，则判定最终鉴定结果为阴性，样品中不带有玉米细菌性枯萎病菌P.s t e w a r t i i,7.4 结果评定 如果7.2.2.1 4检测结果为阳性，且在 7.3.2中各项鉴定结果均为阳性，则判定最终检疫鉴定结果为阳性，样品中带有玉米细菌性枯萎病菌P.s t e w a r t i i;否则判定最终检疫鉴定结果为阴性，样品中不带有玉米细菌