SNT 2676-2010 进出口粮谷中T-2毒素的检测方法 酶联免疫吸附法.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 进出口粮谷中犜 毒素的检测方法酶联免疫吸附法犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犜 犻 狀犮 犲 狉 犲 犪 犾 狊 犳 狅 狉 犻 犿 狆 狅 狉 狋 犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋犈 狀 狕 狔 犿 犲 犾 犻 狀 犽 犲 犱 犻 犿犿 狌 狀 狅 狊 狅 狉 犫 犲 狀 狋 犪 狊 狊 犪 狔 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：孙静克、鲍蕾、张艺兵、吕宁、吴振兴、金莹、田娟、许艳丽。犛 犖犜 进出口粮谷中犜 毒素的检测方法酶联免疫吸附法范围本标准规定了进出口粮谷中 毒素的酶联免疫吸附检测方法。本标准适用于大麦、小麦、高粱、玉米中 毒素的检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。分析实验室用水规格和试验方法方法提要本方法的测定是基于竞争性酶联免疫反应，用甲醇水振荡提取粉碎样品中的 毒素。处理后样品中的 毒素与 毒素酶标记物竞争结合至包被在微孔板上的抗体。通过洗涤除去微孔上未结合的 毒素与 毒素酶标记物，然后加入反应底物，用酶标仪测定吸光度，根据吸光度值得出试样中的 毒素含量。试剂和材料除注明外，所用化学试剂均为分析纯，水为 规定的一级水。毒素检测试剂盒（参见附录）。甲醇。甲醇水提取液：用甲醇和水以的比例配制成提取液备用。毒素标准品：纯度大于等于。毒素标准品溶液的配制：用乙腈作为溶剂配制成 的储备液，于条件下保存。值为 的样品稀释用磷酸盐缓冲液（缓冲液）：分别称取 磷酸二氢钠（），磷酸氢二钠（）和氯化钠，用水溶解并定容至。如果毒素含量较高，需要更高倍稀释时（大于），应向此缓冲液中加入 的甲醇溶液，以保证甲醇溶液的浓度为。仪器和设备 天平：感量 。均质器。涡旋混合器。微量移液器：，。犛 犖犜 多通道微量移液器：。容量瓶：，。酶标仪。粉碎机。离心机：。试样的制备与保存 试样的制备将样品按四分法缩分至，全部磨碎至颗粒可通过 目筛大小，混匀，均分成两份作为试样，分别装入清洁的容器内，密封，并标明标记。在抽样和制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。试样的保存将试样于以下避光保存。分析步骤 提取称取 试样（精确到 ），加入 甲醇水提取液（），均质 ，离心 。离心后取 滤液加入 样品稀释液，混匀。取 进行酶联免疫测定，最后稀释倍数为。高浓度的样品，毒素含量如超出标准曲线范围，可进一步稀释，直至样品中毒素浓度在标准曲线范围以内。测定条件 操作条件所有操作应在室温下（）进行，毒素试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温（）后方可使用。洗板条件人工洗涤次数次以上，每次加入洗涤液量为 ，自动洗板可以预定次。酶标仪测定条件酶标仪测定波长为 。测定步骤 将测定需用的微孔条插入微孔架，记录标准液和样液在微孔架上的位置。吸取 毒素标准液（浓度分别为、）和样液至各微孔。吸取 毒素酶标记物至各微孔，均匀混合，依次加入 毒素抗体，混合，以封口膜将微孔覆盖防止试液挥发，于 黑暗避光处孵育。倒出孔中液体，以 蒸馏水反复清洗微孔，重复操作次以上，将微孔倒置在吸水纸上拍打数次，以保证完全除去微孔中洗液。犛 犖犜 迅速加入 底物至各微孔，于 黑暗避光处孵育 。孵育完毕后加入 反应停止液至各微孔，充分混匀，上酶标仪测量并记录每个微孔试液 波长处的吸光度值（加入反应终止液后应在 内读取吸光度）。平行试验按以上步骤，对同一标准溶液、同一样品溶液均应进行平行试验测定。空白试验除不称取试样外，均按上述步骤进行。阳性质控每次测定均应做一个添加自配 毒素标准品溶液（）的监控样品。以确定实验过程的操作准确性。结果计算标准品和样品的 平均值除以零标准（犃、犃）的平均 值，再乘以 ，计算出各标准液和样品的百分比吸光度值。零标准为 （最大吸光度值），其他 值为最大吸光度值的百分数。以吸光度的百分比值（犅犅）为纵坐标（），毒素标准溶液浓度（）的对数值为横坐标绘制标准工作曲线。从标准工作曲线上得到试样中相应的 毒素浓度后，结果按式（）进行计算。犡犮犞 犿 （）式中：犡 样品中 毒素的残留量，单位为微克每千克（）；犮 从标准工作曲线上得到的样品中 毒素浓度，单位为纳克每毫升（）；犞 样品溶液的最终定容体积，单位为毫升（）；犿 样品溶液所代表的最终试样质量，单位为克（）。也可以用各种酶标仪的数据处理软件进行计算。注：计算结果扣除空白值，所得结果保留一位小数。确证试验如被测样品中 毒素含量的值大于限量要求时，应用其他方法进行确证。本方法测定低限、回收率、精密度 测定低限本方法的测定低限为 。回收率本方法 毒素添加浓度和回收率实验数据：添加量为 时，回收率为 ；添加量为 时，回收率为 ；犛 犖犜 添加量为 时，回收率为 ；添加量为 时，回收率为 。精密度本方法在大麦中的精密度为 ，在高粱中的精密度为 ，在小麦中的精密度为 ，在玉米中的精密度为 。犛 犖犜 附录犃（资料性附录）德国犚 犅 犻 狅 狆 犺 犪 狉 犿试剂盒）犃 试剂和组成犃 包被有抗体的微孔条，条孔。犃 毒素标准液（浓度分别为、）。犃 毒素酶标记物。犃 毒素抗体。犃 底物。犃 样品稀释缓冲液。犃 反应停止液。试剂盒应在避光条件下保存。犃 标准校正曲线标准校正曲线见图。图犃 标准校正曲线）给出该信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对某一产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，需经实验评估后使用这些等效产品。犛 犖犜 犉 狅 狉 犲 狑 狅 狉 犱犜 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱狑 犪 狊狆 狉 狅 狆 狅 狊 犲 犱犫 狔犪 狀 犱 犻 狊狌 狀 犱 犲 狉 狋 犺 犲犮 犺 犪 狉 犵 犲狅 犳 狋 犺 犲犮 犲 狉 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱犪 犮 犮 狉 犲 犱 犻 狋 犪 狋 犻 狅 狀犃 犱 犿 犻 狀 犻 狊 狋 狉 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳 狋 犺 犲犘 犲 狅 狆 犾 犲狊犚 犲 狆 狌 犫 犾 犻 犮狅 犳犆 犺 犻 狀 犪 犜 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱狑 犪 狊犱 狉 犪 犳 狋 犲 犱犫 狔犛 犺 犪 狀 犱 狅 狀 犵犈 狀 狋 狉 狔 犈 狓 犻 狋 犐 狀 狊 狆 犲 犮 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱犙 狌 犪 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲犅 狌 狉 犲 犪 狌狅 犳 狋 犺 犲犘 犲 狅 狆 犾 犲狊犚 犲 狆 狌 犫 犾 犻 犮狅 犳犆 犺 犻 狀 犪 犜 犺 犲犿 犪 犻 狀犱 狉 犪 犳 狋 犲 狉 狊狅 犳 狋 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱犪 狉 犲犛 狌 狀 犼 犻 狀 犵 犽 犲，犅 犪 狅 犾 犲 犻，犣 犺 犪 狀 犵 狔 犻 犫 犻 狀 犵，犔 狀 犻 狀 犵，犠狌 狕 犺 犲 狀 狓 犻 狀 犵，犑 犻 狀 狔 犻 狀 犵，犜 犻 犪 狀 犼 狌 犪 狀，犡 狌 狔 犪 狀 犾 犻 犛 犖犜 犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犜 犻 狀犮 犲 狉 犲 犪 犾 狊犳 狅 狉 犻 犿 狆 狅 狉 狋犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋犈 狀 狕 狔 犿 犲 犾 犻 狀 犽 犲 犱 犻 犿犿 狌 狀 狅 狊 狅 狉 犫 犲 狀 狋犪 狊 狊 犪 狔犛 犮 狅 狆 犲犜 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱狊 狆 犲 犮 犻 犳 犻 犲 狊 狋 犺 犲犿 犲 狋 犺 狅 犱狅 犳 狊 犪 犿 狆 犾 犲狆 狉 犲 狆 犪 狉 犪 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱犱 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀犫 狔犈 犔 犐 犛 犃犿 犲 狋 犺 狅 犱狅 犳犜 狋 狅 狓 犻 狀 犻 狀犮 犲 狉 犲 犪 犾 狊犳 狅 狉 犻 犿 狆 狅 狉 狋犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋 犜 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱 犻 狊犪 狆 狆 犾 犻 犮 犪 犫 犾 犲 狋 狅狋 犺 犲 犳 犪 狊 狋 犱 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犜 狋 狅 狓 犻 狀 犻 狀犫 犪 狉 犾 犲 狔，狑 犺 犲 犪 狋，狊 狅 狉 犵 犺 狌 犿犪 狀 犱犮 狅 狉 狀 犖 狅 狉 犿 犪 狋 犻 狏 犲狉 犲 犳 犲 狉 犲 狀 犮 犲 狊犜 犺 犲犳 狅 犾 犾 狅 狑 犻 狀 犵狀 狅 狉 犿 犪 狋 犻 狏 犲犱 狅 犮 狌 犿 犲 狀 狋 狊犮 狅 狀 狋 犪 犻 狀狆 狉 狅 狏 犻 狊 犻 狅 狀狑 犺 犻 犮 犺，狋 犺 狉 狅 狌 犵 犺狉 犲 犳 犲 狉 犲 狀 犮 犲犻 狀狋 犺 犻 狊狋 犲 狓 狋，犮 狅 狀 狊 狋 犻 狋 狌 狋 犲 狊狆 狉 狅 狏 犻 狊 犻 狅 狀狅 犳 狋 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱 犉 狅 狉 犱 犪 狋 犲 犱 狉 犲 犳 犲 狉 犲 狀 犮 犲 狊，狊 狌 犫 狊 犲 狇 狌 犲 狀 狋 犪 犿 犲 狀 犱 犿 犲 狀 狋 狊（犲 狓 犮 犾 狌 犱 犲犮 狅 狉 狉 犲 犮 狋 犻 狅 狀）狋 狅，狅 狉 狉 犲 狏 犻 狊 犻 狅 狀 狊狅 犳，犪 狀 狔狅 犳 狋 犺 犲 狊 犲狆 狌 犫 犾 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀 狊犱 狅狀 狅 狋犪 狆 狆 犾 狔 犎 狅 狑 犲 狏 犲 狉狆 犪 狉 狋 犻 犲 狊狋 狅犪 犵 狉 犲 犲 犿 犲 狀 狋 狊犫 犪 狊 犲 犱狅 狀狋 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱犪 狉 犲犲 狀 犮 狅 狌 狉 犪 犵 犲 犱 狋 狅 犻 狀 狏 犲 狊 狋 犻 犵 犪 狋 犲 狋 犺 犲狆 狅 狊 狊 犻 犫 犻 犾 犻 狋 狔狅 犳 犪 狆 狆 犾 狔 犻 狀 犵 狋 犺 犲犿 狅 狊 狋 狉 犲 犮 犲 狀 狋 犲 犱 犻 狋 犻 狅 狀 狊狅 犳 狋 犺 犲狀 狅 狉 犿 犪 狋 犻 狏 犲犱 狅 犮 狌 犿 犲 狀 狋 狊 犻 狀 犱 犻 犮 犪 狋 犲 犱犫 犲 犾 狅 狑 犉 狅 狉狌 狀 犱 犪 狋 犲 犱狉 犲 犳 犲 狉 犲 狀 犮 犲 狊，狋 犺 犲犾 犪 狋 犲 狊 狋犲 犱 犻 狋 犻 狅 狀狅 犳狋 犺 犲狀 狅 狉 犿 犪 狋 犻 狏 犲犱 狅 犮 狌 犿 犲 狀 狋 狉 犲 犳 犲 狉 狉 犲 犱狋 狅犪 狆 狆 犾 犻 犲 狊 犌 犅犜 犠 犪 狋 犲 狉 犳 狅 狉犪 狀 犪 犾 狔 狋 犻 犮 犪 犾 犾 犪 犫 狅 狉 犪 狋 狅 狉 狔狌 狊 犲犛 狆 犲 犮 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱狋 犲 狊 狋犿 犲 狋 犺 狅 犱 狊犘 狉 犻 狀 犮 犻 狆 犾 犲犜 犺 犲犫 犪 狊 犻 狊狅 犳 狋 犺 犲狋 犲 狊 狋 犻 狊狋 犺 犲犪 狀 狋 犻 犵 犲 狀 犪 狀 狋 犻 犫 狅 犱 狔狉 犲 犪 犮 狋 犻 狅 狀 犜 犺 犲犿 犻 犮 狉 狅 狋 犻 狋 犲 狉狑 犲 犾 犾 狊犪 狉 犲犮 狅 犪 狋 犲 犱狑 犻 狋 犺犮 犪 狆 狋 狌 狉 犲犪 狀 狋 犻 犫 狅 犱 犻 犲 狊犱 犻 狉 犲 犮 狋 犲 犱犪 犵 犪 犻 狀 狊 狋犪 狀 狋 犻 犜 狋 狅 狓 犻 狀犪 狀 狋 犻 犫 狅 犱 犻 犲 狊 犜 犺 犲狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱 狊，狋 犺 犲狊 犪 犿 狆 犾 犲 狊犪 狀 犱狋 犺 犲犲 狀 狕 狔 犿 犲犮 狅 狀 犼 狌 犵 犪 狋 犲犪 狉 犲犪 犱 犱 犲 犱狋 狅狋 犺 犲 犿 犻 犮 狉 狅 狆 犾 犪 狋 犲 狑 犲 犾 犾 狊 犇 狌 狉 犻 狀 犵狋 犺 犲犳 犻 狉 狊 狋犻 狀 犮 狌 犫 犪 狋 犻 狅 狀，狋 犺 犲 狉 犲犻 狊犪犮 狅 犿 狆 犲 狋 犻 狋 犻 狅 狀犪 犿 狅 狀 犵狋 犺 犲犳 狉 犲 犲犿 狅 犾 犲 犮 狌 犾 犲 狊，犾 犻 犽