SNT 2482-2010 马铃薯丛枝植原体检疫鉴定方法.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 马铃薯丛枝植原体检疫鉴定方法犐 犱 犲 狀 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳狆 狅 狋 犪 狋 狅狑 犻 狋 犮 犺 犲 狊犫 狉 狅 狅 犿狆 犺 狔 狋 狅 狆 犾 犪 狊 犿 犪 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准的附录 和附录均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院负责起草。本标准主要起草人：王秀芬、赵文军、刘伟、彭金火、牟海青、周铭、朱水芳。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛 犖犜 马铃薯丛枝植原体检疫鉴定方法范围本标准规定了马铃薯丛枝植原体的检疫鉴定方法。本标准适用于所有进境种薯、商品薯、组培苗和脱毒苗等马铃薯种质中马铃薯丛枝植原体的检疫鉴定。原理 学名和分类地位学名：缩写：分类地位：细菌界（），硬壁菌门（），柔膜菌纲（），非固醇菌原体目（），非固醇菌原体科（），植原体属（犘 犺 狔 狋 狅 狆 犾 犪 狊 犿 犪），三叶草丛蔟组（，）。其他资料参见附录。鉴定原理马铃薯丛枝植原体的分子生物学特性为本标准鉴定方法的主要依据。仪器和用具 仪器设备：仪、超净工作台、电泳仪、凝胶成像分析仪、冷冻离心机、电子天平（）、计、水浴锅、振荡器等。用具；可调移液器（、）及相关吸头、研钵、离心管（、）、管（）、量筒、烧杯、镊子等。试剂 研磨液磷酸氢二钠（）磷酸二氢钠（）（）蔗糖（质量浓度）（质量浓度）调整 至，然后过滤除菌。使用前加入 （质量浓度）牛血清白蛋白（）和 抗坏血酸维生素。犆 犜 犃 犅缓冲液 （质量浓度）（）（）氯化钠（）（质量浓度）犛 犖犜 w w w.b z f x w.c o m 其他试剂苯酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙醇、琼脂糖、溴化乙锭、犜 犪 狇 聚合酶、缓冲液、液（，）。检疫鉴定 犇 犖 犃提取大约 组织（叶柄、叶脉、茎）在 预冷研磨液中研磨，将粗汁液转移至 微量离心管中。下 离心 。将悬浮液转至新的 离心管中。下 离心 。去掉上清液。在 预 热（）缓 冲 液 中 悬 浮 沉 淀 少 量 缓 冲 液（如 ）更易悬浮沉淀，然后加入剩余的 缓冲液（如 ）。下孵育 ，间歇颠倒混匀。离心管在冰上冷却。加入 三氯甲烷异戊醇（体积比），涡旋振荡。或室温下 离心 。小心将上面水相转至一个新的 离心管中。加入体积预冷异丙醇，涡旋振荡。冰上孵育 后或室温下 离心 。去掉上清液。用 （体积分数）冷乙醇洗涤 沉淀，或室温下 离心 。空气干燥 沉淀。用 灭菌蒸馏水悬浮沉淀。下孵育离心管 有助于 再悬浮。短期贮存或 长期贮存。注：也可采用商品试剂盒提取。引物序列引物采用植原体 （参见附录）通用引物 和 。引物序列见表。表犘 犆 犚检测的引物引物名称引物序列 产物 通用引物 巢式犘 犆 犚用引物 进行第轮 。反应体系见表。反应条件为：；，个循环；。表犘 犆 犚反应体系试剂名称加样量 缓冲液 氯化镁 上游引物 下游引物 犜 犪 狇 聚合酶 模板 双蒸水补足反应总体积为 第轮 产物用灭菌双蒸水（体积比）稀释，取为模板利用通用引物 进行第轮 反应，反应体系见表。反应条件为：；，犛 犖犜 w w w.b z f x w.c o m ，个循环；。上述反应中均需同时作阳性对照（植原体 质粒）、阴性对照（健康马铃薯叶片）和空白对照（以蒸馏水替代模板 ）。用 电泳缓冲液制备的琼脂糖凝胶（含 溴化乙锭），用 加样缓冲液与第轮 扩增产物混合，然后将其和适合的 分子量标准物分别加入到样品孔中。电泳结束后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统观察并保留结果。犘 犆 犚产物序列 犚 犉 犔 犘图谱分析将第二轮 产物进行序列测定。所测序列通过 软件进行 图谱分析，分子量标准选用 ，琼脂糖凝胶浓度为，最小片段选为 。结果评定在阳性对照有目标条带，而阴性对照及空白对照没有条带时，第二轮 产物在 处有条带出现，且序列 图谱分析结果与马铃薯丛枝植原体标准图谱一致，即判断样品带有马铃薯丛枝植原体；第二轮 产物在 处没有条带，判定样品不带有马铃薯丛枝植原体。样品保存对于检测结果显示为阳性的样品，应对样品进行保存。病样在 或者 冰箱中保存，做好标记和登记工作。结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、接收时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。检测需有电泳结果照片及测序结果。犛 犖犜 w w w.b z f x w.c o m附录犃（资料性附录）马铃薯丛枝植原体背景资料犃 分布亚洲：中国（台湾）、印度、日本、乌兹别克斯坦。欧洲：保加利亚、前苏联（欧洲部分）、意大利、波兰、俄罗斯联邦（欧洲部分）、乌克兰。大洋洲：澳大利亚、汤加。北美洲：加拿大、美国。犃 寄主范围荷包牡丹（犇 犻 犮 犲 狀 狋 狉 犪 狊 狆 犲 犮 狋 犪 犫 犻 犾 犻 狊）、紫苜蓿（犕 犲 犱 犻 犮 犪 犵 狅 狊 犪 狋 犻 狏 犪）、马铃薯（犛 狅 犾 犪 狀 狌 犿狋 狌 犫 犲 狉 狅 狊 狌 犿）、杂种车轴草（犜 狉 犻 犳 狅 犾 犻 狌 犿犺 狔 犫 狉 犻 犱 狌 犿）、红车轴草（犜 狉 犻 犳 狅 犾 犻 狌 犿狆 狉 犪 狋 犲 狀 狊 犲）、白 车 轴 草（犜 狉 犻 犳 狅 犾 犻 狌 犿狉 犲 狆 犲 狀 狊）、烟草（）、长春花（犆 犪 狋 犺 犪 狉 犪 狀 狋 犺 狌 狊 狉 狅 狊 犲 狌 狊）、柳属（犛 犪 犾 犻 狓）。犃 症状感病马铃薯植株徒长，顶部叶片变紫色并卷曲，花变绿色、僵化，露出土表的马铃薯部分长出很多枝芽，并长出许多匍匐枝，土表下的马铃薯块茎长出许多根，上部植株胶质化，茎干细小，生产的马铃薯个体小，产量低。病害后期植株维管束死亡，植株枯死。犃 传播途径马铃薯种薯及组培苗是该病原菌远距离传播主要途径，叶蝉（犛 犮 犾 犲 狉 狅 狉 犪 犮 狌 狊犳 犾 犪 狏 狅 狆 犻 犮 狋 狌 狊、犛 犮 犾 犲 狉 狅 狉 犪 犮 狌 狊犱 犪 狊 犻 犱 狌 狊、犛 犮 犾 犲 狉 狅 狉 犪 犮 狌 狊 犫 犪 犾 犾 犻）是传播介体。犃 分子生物学特性植原体基因组包括染色体与染色体外（质粒）两部分，遗传物质为 ，相对分子质量约为 道尔顿。此外，植原体基因组 中，含量较低，为 ，含量较丰富。基因是原核生物的高度保守序列，在植原体及其他支原体原核生物的分类研究中，它常作为系统分类比较的主要特征。犃 病菌形态特征马铃薯病株茎、叶筛管和靠近筛管的薄壁细胞细胞质内，有大小不一，形态多数为球形或椭圆形的植原体存在。植原体初生体的直径多为 ，呈电子密集及微颗粒状。植原体屋细胞壁，但在其外表包有单位膜。单位膜由层蛋白质膜和中间一层脂肪膜组成，厚度约为 。在显微镜下，植原体的内含物清晰可见，胞内含有核糖体，脱氧核糖核酸线状体和核糖核酸线状体。犛 犖犜 w w w.b z f x w.c o m附录犅（资料性附录）马铃薯丛枝植原体核糖体 犛狉 犇 犖 犃序列犅 马铃薯丛枝植原体核糖体 犛狉 犇 犖 犃序列（引物 犚 犉 狀犚 犚 扩增产物）犛 犖犜 w w w.b z f x w.c o m犅 马铃薯丛枝植原体核糖体 犛狉 犇 犖 犃序列指纹图谱图 犅 马铃薯丛枝植原体核糖体 犛狉 犇 犖 犃序列指纹图谱犛 犖犜 w w w.b z f x w.c o m书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准马铃薯丛枝植原体检疫鉴定方法 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京复兴门外三里河北街 号邮政编码：网址 电话：中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号：定价 元