SNT 2351-2009 出入境口岸军团菌检验规程.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 出入境口岸军团菌检验规程犈 狓 犪 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀犮 狅 犱 犲 狊狅 犳犾 犲 犵 犻 狅 狀 犲 犾 犾 犪犪 狋 犳 狉 狅 狀 狋 犻 犲 狉狆 狅 狉 狋 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售食品伙伴网http:/书书书前言本标准的附录为规范性附录，附录、附录、附录 为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：朱玉兰、吴兵、高朝贤、朱海、杨泽、叶健忠、古莉冰、刘志明。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售食品伙伴网http:/出入境口岸军团菌检验规程范围本标准规定了出入境口岸军团菌检验对象、方法、结果报告、生物安全要求及阳性结果判定、处置。本标准适用于出入境口岸军团菌的检验。规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是未注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。实验室生物安全通用要求 军团病诊断标准及处理原则术语和定义下列术语和定义适用于本标准。军团病 犾 犲 犵 犻 狅 狀 狀 犪 狉 犻 狉 犲 狊犱 犻 狊 犲 犪 狊 犲，犔 犇军团菌属（主要是军团菌）引起的细菌性呼吸道传染病，临床表现有两种类型：非肺炎型和肺炎型。军团菌犾 犲 犵 犻 狅 狀 犲 犾 犾 犪引起军团病的病原菌，系兼性细胞内寄生的革兰阴性杆菌，军团菌是人军团病的主要致病菌。实验室生物安全防护实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备及个体防护应符合 中二级生物安全防护实验室的要求。对象 疑似感染军团菌的出入境人员。环境污染标本。准备 检验试剂 细菌培养鉴定及聚合酶链反应（）试剂的制备参见附录，或购买符合要求的商品化检测试剂盒。直接荧光抗体染色（）、血清学检验及尿抗原检测见 或购买符合要求的商品化试剂。仪器设备仪器设备参见附录。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售食品伙伴网http:/标本的采集和处理 疑似感染者标本的采集 发病期患者的痰液、纤支镜毛刷标本、支气管灌洗液和肺组织可进行病原学检测，常规采样后立即送检，采样过程中应使用无菌蒸馏水。无菌方法采集发病期患者胸水，用有盖无菌试管保存，立即送检。用于培养的尿液标本采样前应清洗并消毒患者尿道口，留取中段尿 于无菌容器中，立即送检。用于尿抗原检测的标本可常规留取中段尿。用不抗凝的真空管采集并保存患者急性期（发病内）、第周、第周血清用于血清学检测。疑似感染者标本的处理 肺组织用蒸馏水在无菌条件下制成悬液，痰液、纤支镜毛刷标本、支气管灌洗液、肺组织悬液经酸处理或热处理后进行培养（见）。无菌方法采集的胸水、消毒尿道口留取的中段尿、血液等正常情况下无菌的标本无需处理直接用于培养。血清学试验的血液采集后室温放置后，离心 ，分离出血清。环境污染标本采集水样用无菌容器采集 ，尘土和泥土用无菌蒸馏水制成悬液。水样中如果含有含氯或其他氧化剂，应在取样时或取样前加入硫代硫酸钾或相应的非活性试剂中和。从样品采集、浓缩到送检间隔不超过，实验室接到水样后应尽快进行微生物学分析。环境污染标本处理 膜过滤法采用膜过滤装置进行膜过滤，采用直径 ，孔径 的膜。过滤后的膜应放置在带盖的无菌容器中，可用无菌剪刀剪碎，加 的无菌稀释液或无菌蒸馏水，不断摇动至少 。也可将容器放入超声波中 。离心法取 样品于 容积的离心瓶中，离心 或 离心 ，保持温度在 ，弃去上清液，将沉淀物悬浮在 无菌蒸馏水中。酸处理和热处理 处理目的为减少痰液、纤支镜毛刷标本、支气管灌洗液和肺组织悬液等正常情况有菌的标本和环境污染标本中的杂菌生长，标本需进行酸处理或热处理。同一容器内的标本只能选择酸处理或热处理中的一项，两种处理方法不能重复。酸处理取患者痰液、纤支镜毛刷标本、支气管灌洗液和肺组织悬液等标本，转移至有盖无菌试管中。取经 处理过的环境污染标本 ，转移至有盖无菌试管中，离心 ，用无菌枪头吸去 体积的上清液，通过涡旋重新悬浮剩余物。每个装有 标本的有盖无菌试管中加入 酸性缓冲液，混匀，室温静置 。加入碱中和试剂，调至未加酸性缓冲液时的 值，静置 ，待查。热处理取患者痰液、纤支镜毛刷标本、支气管灌洗液和肺组织悬液等临床标本或环境污染标本，转移至有盖无菌容器中，水浴处理 。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售食品伙伴网http:/实验室检验方法 细菌培养鉴定，见附录。尿液中抗原的检测，采用免疫层析法，按照相应商品化试剂说明书（以美国 公司 试剂为例），参见附录。聚合酶链反应（）检测，参见附录。直接荧光抗体染色按照 。血清学检测按照 或按照商品化试剂说明书。注：其他符合检测要求的商品化试剂盒，在验证合格后均可参照使用，本标准不做推荐。结果判定与报告 细菌培养鉴定报告 标本中培养出军团菌，报告“细菌培养检出军团菌”。培养基或 培养基 内未见可疑菌落，报告“细菌培养，未检出军团菌”。尿抗原检测报告 尿抗原检测阳性，报告“尿军团菌抗原阳性”。尿抗原检测阴性，报告“尿军团菌抗原阴性”。犘 犆 犚检验报告 检测阳性，报告“军团菌 检测阳性”。检测阴性，报告“军团菌 检测阴性”。血清学试验报告 血清学试验阳性，报告“军团菌抗体阳性”。血清学试验阴性，报告“军团菌抗体阴性”。阳性结果的处置 细菌分离培养阳性的菌株应传代保存，疫情报告上级主管部门，同时向当地卫生行政主管部门及疾病预防控制中心通报。血清学检测、尿抗原检测结果阳性或可疑阳性的标本，宜选择直接免疫荧光抗体染色及细菌分离培养和 方法进行复检验证。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售食品伙伴网http:/附录犃（资料性附录）军团菌检验主要试剂及器材犃 主要试剂犃 培养基的主要成分及制备方法犃 犅 犆 犢 犈 培养基配方 乙酰氨基 氨基乙烷磺酸（）酵母浸膏（细菌学级）可溶性焦磷酸铁 活性炭 琼脂 半胱氨酸 氢氧化钾（分析纯）酮戊二酸一钾盐 蒸馏水 犃 犅 犆 犢 犈 培养基制备方法将 加到含 蒸馏水的烧瓶中，置 水浴约，直到 完全溶解。将干燥的活性炭、酵母浸膏、琼脂和 酮戊二酸加入溶液中，充分混合。再加入 蒸馏水，高压灭菌 ，取出后，放 水浴中保温。将 半胱氨酸、焦磷酸铁分别溶于 蒸馏水中，并用 孔径的滤菌器过滤除菌，加入上述液体中，充分混匀。用 调整 至 。犃 犅 犆 犢 犈 犆 狔 狊培养基 培养基配方去掉 半胱氨酸，按 方法制备。犃 犌 犞 犘 犆选择性培养基按 方法制备，在加入 半胱氨酸、焦磷酸铁后，每升另加入：甘氨酸 万古霉素 放线菌酮 多粘菌素 万 犃 酸性缓冲液 液：氯化钾溶液（）液：盐酸（）取 份 液和份液，混匀，为。犃 碱中和试剂的配制液：氢氧化钾溶液（）取液 加 蒸馏水，为 。犃 犘 犆 犚试剂犃 盐酸（），浓盐酸调整 值。犃 缓冲液：盐酸（），（）。犃 缓冲液：氯化钾（），氯化镁（），盐酸，。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售食品伙伴网http:/犃 电泳缓冲液：碱，冰乙酸，（），加蒸馏水至 ，使用时 倍稀释。犃 缓冲液：在 蒸馏水中溶解 氯化钠（）和 柠檬酸钠，加入数滴 氢氧化钠（）溶液调节 值至，加水定容至，分装后高压灭菌。犃 琼脂糖（电泳级）犃 器材犃 细菌培养器材 培养皿（、）；蠕动泵；滤膜滤器；旋涡振荡器；离心机；光学显微镜；解剖显微镜；全排式生物安全柜；恒温培养箱；除菌滤膜；高压蒸汽灭菌器；玻璃吸管（、）、量筒（、）、三角烧瓶（、）；电子天平秤（精确到 ）；普通冰箱。犃 犘 犆 犚器材 离心机；仪；电泳仪；可调移液器：、；凝胶成像仪。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售食品伙伴网http:/附录犅（规范性附录）细菌培养鉴定犅 初培养将酸处理或热处理的标本 离心 ，用无菌吸管吸弃上清液，保留 重新悬浮沉淀物，正常情况无菌的标本直接用于培养。用无菌吸管吸取沉淀物悬液或正常情况无菌的标本，分别滴加滴滴在 军团菌专用培养基和 选择性培养基上，划线接种或涂布接种。，培养箱中培养，连续观察，军团菌在 培养基上的菌落通常呈现白色、灰色、蓝色、紫色，但也可能出现棕色、粉色、灰绿色或深红色。军团菌表面光滑，边缘整齐，出现典型的毛玻璃现象。发现上述菌落即为军团菌可疑菌落，进行下一步分离培养鉴定。无可疑菌落，培养顺延到，报告“细菌培养 天，未检出军团菌”。犅 分离培养挑取初培养可疑菌落分别在 培养基和 培养基或血平板上划线接种。，培养箱中培养。观察，在 培养基上见到菌落形成而 或血平板上未见生长，即初步判定为军团菌，用军团菌诊断血清做分型试验进一步验证。聚合酶链反应（）可辅助用于军团菌的鉴定，作为参考。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售食品伙伴网http:/附录犆（资料性附录）尿抗原检测犆 原理 公司的 军团菌尿抗原检测试剂采用兔抗军团菌型抗体标记的免疫层析试验，用来检测尿液中可溶性军团菌型抗原。犆 操作步骤犆 将患者的尿液和检测试剂平衡到室温（），从包装袋中取出检测设备。犆 用 专用棉签蘸取待测尿液，并使之完全覆盖专用棉签。如果棉签上有尿液滴下，将棉签触到尿液容器的边上以移去多余尿液。犆 检测卡内部的右侧板上有个孔，将蘸有尿样的棉签从底孔插入，慢慢向上，直到使棉签头部在顶部的孔中充分可见为止，不要移走棉签。犆 垂直握住试剂 瓶，离检测设备 的高度，垂直在底孔内滴入滴试剂。犆 立即拉开检测卡右测边缘上的粘条，合上检测卡，完全封住。后通过窗口读取结果。犆 结果判断阴性结果：检测卡窗口上方出现一条紫色的对照线。阳性结果：检测卡窗口出现两条紫色的线。试剂无效：检测卡窗口看不到任何线条或只有样品检测线出现。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售食品伙伴网http:/附录犇（资料性附录）聚合酶链反应检测犇 扩增引物下列是根据军团菌基因设计的一对引物，具有高度特异性，供使用时参考。阳性标本可扩增出 的片段。上游引物：下游引物：犇 模板制备犇 菌种的模板制备犇 取实验菌株对数生长期菌落，稀释一定浓度（），取 菌悬液，溶于 中。犇 加入溶菌酶（），水浴 。犇 加入 （），水浴 （变清为止），室温冷却。犇 加入蛋白酶（）。犇 加入 酶（）。犇 加入 酚 三氯甲烷 异戊醇混匀液，抽提次。犇 加入冰乙醇，离心 ，弃上水相，自然干燥，加入 ，保存待测。犇 临床标本的模板制备犇 取血、胸水，弃上清液，加 。犇 煮沸 ，室温冷却。犇 加入 酶（）。犇 离心 ，取上清 用于 扩增。犇 环境污染标本的模板制备标本按 处理并浓缩，浓缩后的标本按 处理。犇 扩增犇 取无菌的 扩增管，设置阴性对照、阳性对照，将样品编号，按照以下加样量加样：模板 缓冲液（含氯化镁）（）上游引物（）下游引物（）犜 犪 狇酶（）双蒸水 犇 混匀，离心 ，将管内液体甩入管底。犇 设置扩增反应条件：；，个循环；最后 ，进行 扩增。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售食品伙伴网http:/犇 电泳取 扩增产物，加入溴酚蓝上样缓冲液，混匀，在 琼脂糖凝胶（含 溴化乙锭）加样，以 稳定电压电泳 ，用凝胶成像系统观察结果。犇 结果判定如阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条带（扩增片段大小为 ），则可初步判定该样品军团菌 检验阳性，应进一步进行测序验证；如果待测样品中未出现 扩增产物，则可判断待测样品军团菌 检验阴性。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售食品伙伴网http:/书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出入境口岸军团菌检验规程 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京复兴门外三里河北街 号邮政编码：网址 电话：中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数 千字 年 月第一版 年 月第一