SNT 2425-2010 进出口食品中霍乱弧菌快速及鉴定监测方法 实时荧光PCR方法.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 进出口食品中霍乱弧菌快速及鉴定检测方法实时荧光犘 犆 犚方法犚 犪 狆 犻 犱犱 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀狅 犳犞 犻 犫 狉 犻 狅犮 犺 狅 犾 犲 狉 犪 犲犻 狀犳 狅 狅 犱 狊 犳 狅 狉 犻 犿 狆 狅 狉 狋 犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋犚 犲 犪 犾 狋 犻 犿 犲狇 狌 犪 狀 狋 犻 狋 犪 狋 犻 狏 犲犘 犆 犚犿 犲 狋 犺 狅 犱 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准的附录、附录均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中山大学达安基因有限公司。本标准主要起草人：焦红、翁文川、刘超、易敏英、许龙岩、胡科锋、程钢、王方金。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛 犖犜 进出口食品中霍乱弧菌快速及鉴定检测方法实时荧光犘 犆 犚方法范围本标准规定了进出口食品中霍乱弧菌的实时荧光 快速检验及鉴定方法。本标准适用于进出口食品中霍乱弧菌 群、群、非 非 群的快速检验，以及 群、群的快速鉴定。规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。霍乱诊断标准及处理原则 出口食品中霍乱弧菌检验方法 基因检验实验室技术要求缩略语下列缩略语适用于本标准。犘 犆 犚狆 狅 犾 狔 犿 犲 狉 犪 狊 犲 犮 犺 犪 犻 狀狉 犲 犪 犮 狋 犻 狅 狀聚合酶链式反应，简称 。实时荧光犘 犆 犚实时荧光聚合酶链式反应。犇 犖 犃犱 犲 狅 狓 狔 狉 犻 犫 狅 狀 狌 犮 犾 犲 犻 犮犪 犮 犻 犱简称脱氧核糖核酸。犱 犖 犜 犘犱 犲 狅 狓 狔 狉 犻 犫 狅 狀 狌 犮 犾 犲 狅 狊 犻 犱 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 狆 犺 犪 狋 犲脱氧核苷酸三磷酸。犱 犃 犜 犘犱 犲 狅 狓 狔 犪 犱 犲 狀 狅 狊 犻 狀 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 狆 犺 犪 狋 犲脱氧腺苷三磷酸。犱 犆 犜 犘犱 犲 狅 狓 狔 犮 狔 狋 犻 犱 犻 狀 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 狆 犺 犪 狋 犲脱氧胞苷三磷酸。犱 犌 犜 犘犱 犲 狅 狓 狔 犵 狌 犪 狀 狅 狊 犻 狀 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 犺 狆 犪 狋 犲脱氧鸟苷三磷酸。犛 犖犜 犱 犜 犜 犘犱 犲 狅 狓 狔 狋 犺 狔 犿 犻 犱 犻 狀 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 狆 犺 犪 狋 犲脱氧胸苷三磷酸。犱 犝 犜 犘犱 犲 狅 狓 狔 狌 狉 犻 犱 犻 狀 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 狆 犺 犪 狋 犲脱氧鸟苷三磷酸。犝 犖 犌狌 狉 犪 犮 犻 犾犖 犵 犾 狔 犮 狅 狊 狔 犾 犪 狊 犲尿嘧啶犖 糖基化酶。犜 狉 犻 狊 狋 狉 犻 狊（犺 狔 犱 狉 狅 狓 狔 犿 犲 狋 犺 狔 犾）犪 犿 犻 狀 狅 犿 犲 狋 犺 犪 狀 犲三（羟甲基）氨基甲烷。犆 狋值每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。犜 犪 狇酶犜 犪 狇 聚合酶。测定方法 方法提要采用犜 犪 狇 方法，在比对霍乱弧菌溶血素基因、编码 抗原的 基因的基础上，分别设计三对各自仅在霍乱弧菌的溶血素基因、基因间保守的特异性引物和三条特异性的荧光双标记探针。探针的结合部位均位于目的扩增片段内部。其中 端标记了 荧光素为报告荧光基团（用 表示），端标记了 荧光素为淬灭荧光基团（用 表示），它在近距离内能吸收 端荧光基团发出的荧光信号。反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上 基团发出的荧光信号被 基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，犜 犪 狇 聚合酶发挥其 外切核酸酶功能，将探针降解。这样探针上的 基团游离出来，所发出的荧光不再为 所吸收而被检测所接收。随着 反应的循环往复，产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长，实现了荧光信号的累积与 产物形成完全同步。培养基和试剂 碱性蛋白胨水增菌液（见附录）。灭菌双蒸水。离心管：、。吸管：、，分刻度 。成套试剂盒配置 引物（已配成成品），有三种，分别为：霍乱弧菌通用型，引物上游：下游：霍乱弧菌 群，引物上游：下游：霍乱弧菌 群，引物上游：下游：犛 犖犜 探针（已配成成品），有三种，分别为：霍乱弧菌通用型，霍乱弧菌 群，霍乱弧菌 群，探针 端由 标记，端由 标记。犜 犪 狇 酶。：、。提取试剂。缓冲液：盐酸（），氯化钾，氯化镁。仪器和设备 全自动荧光定量 仪（或者普通 仪和荧光检测仪）。离心机：。制冰机。恒温培养箱。低温冰箱；。恒温水浴箱。天平：量程，感量。均质器。样品稀释瓶：、。灭菌样品处理器具：取样勺、剪刀、镊子。可调移液器：、。步骤 样品的收集和处理称取检样，加入装有 碱性蛋白胨水增菌液（）的广口瓶内。固体样品应以均质器 打碎，或以剪刀充分剪碎，培养和 。准备进行模板 的提取。若为牡蛎样品，应同样制备另一检样，置于 中，培养和 。无需增菌培养，直接检测样品处理与上述增菌培养过程一致，但无需进行增菌培养，样品与稀释液混合均匀后，即可进行模板 的提取。荧光定量犘 犆 犚测定 模板犇 犖 犃的提取从样品增菌液的表层（或样品稀释液管中）取 培养液加入到 无菌离心管中，离心 ，尽量弃去上清液，加入 灭菌的双蒸水清洗次后离心，同样尽量弃去上清液。加入 提取液充分混匀，室温放置 后，进行沸水浴 ，离心 ，将上清液转移至新管备用（不能及时检验，则放置于 保存）。和 的样品增菌液分别提取 进行检测。荧光定量犘 犆 犚检验 检验准备根据需要选择使用：霍乱弧菌通用型、霍乱弧菌 群及霍乱弧菌 群鉴定试剂盒。扩增反应总体积为：模板，引物上、下游各 ，荧光探针 ，缓冲液，犜 犪 狇 聚合酶（），用纯水补足至。检犛 犖犜 验过程中分别设置阳性、阴性对照及空白对照。以含有扩增片断的质粒为阳性对照，以灭菌双蒸水为阴性对照（均由试剂盒配套供给）。全自动荧光定量犘 犆 犚仪的使用在荧光定量 仪上的设定扩增条件为：，预变性；，变性；，退火及延伸，个循环，保存。普通犘 犆 犚仪和荧光检测器的使用使用普通 仪合并荧光检测器测试分两步进行，第一步：仪扩增反应条件设为，预变性；，变性；，退火及延伸，个循环，暂停，迅速逐个将反应管放入荧光检测仪，读取并记录读数犃。第二步：仪扩增反应条件设为，预变性；，变性；，退火及延伸，个循环，暂停，同样迅速逐个将扩增后的反应管放入荧光检测仪，读取并记录读数犃。荧光激发波长为 ，检测波长为 。结果及判断 全自动荧光定量犘 犆 犚仪 阈值设定读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。质控标准阴性质控品：增长的曲线不呈型曲线或 值。阳性质控品：增长曲线呈 型曲线，且强阳性质控品定量参考值在 基因拷贝 基因拷贝 范围，临界阳性质控品定量参考值在 基因拷贝 基因拷贝 范围。阳性定量参考品：增长曲线呈型曲线，值小于 。以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。结果描述及判定 阴性增长的曲线不呈型曲线或 值等于，表示样品中无霍乱弧菌。阳性增长曲线呈型曲线且 值小于，表示样本中存在有霍乱弧菌。实验灰度区若 值，实验需要重新进行。若重做结果的 值小于，且增长曲线呈型曲线，则判为阳性；否则增菌后复检。普通犘 犆 犚仪和荧光检测器计算每个样品荧光检测器两步结果的差：犃狓犃犃。将阴性质控品管的犃狓称为犖，临界阳性标准品的犃狓值称为犘，强阳性标准品的犃狓称为犘。实验要求满足：阴性质控品，全部阴性；阳性标准品，全部阳性；同时，犘、犘、犖应满足犘犘犖，则本次实验有效；否则，实验无效，应检查试剂、仪器、反应条件等方面的误差。在实验有效的前提下，样品犃狓犖（犘犖）判为阳性；如果犖（犘犖）犃狓犖（犘犖）则属于实验灰度区，需重复实验一次，若重复实验结果犃狓值犖（犘犖）判为阳性，否则判为阴性；如果犃狓值犖（犘犖）判为阴性。实时荧光犘 犆 犚方法检验霍乱弧菌的灵敏度经 培养增菌，样品的检测低限为：霍乱弧菌 群荧光 试剂、霍乱弧菌 群荧光 犛 犖犜 试剂、霍乱弧菌通用型荧光 试剂均为 ；若不经过增菌，上述三种试剂的检测低限为 。确证检验筛选出阳性的样本，按 和 进行确证。结果报告如果霍乱弧菌通用型检测结果阳性，判断可能为 、群、非 群、非 群中任一种阳性。继续则进行霍乱弧菌 群、霍乱弧菌 群检测。阳性结果，则可报告霍乱弧菌 群（或 群）筛选结果阳性，如果两个结果均为阴性，则可报告霍乱弧菌非 非 群结果阳性。本标准的检验程序见附录。防止污染和废弃物处理的措施检验过程中防止交叉污染的措施按照 的规定执行。检验过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中焚烧处理。犛 犖犜 附录犃（规范性附录）培养基和试剂碱性蛋白胨水（）蛋白胨 氯化钠 蒸馏水 混匀后，调节 值至（），分装 于 广口瓶中，高压灭菌 。犛 犖犜 附录犅（规范性附录）荧光犘 犆 犚检验方法程序犛 犖犜 书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准进出口食品中霍乱弧菌快速及鉴定检测方法实时荧光犘 犆 犚方法 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京复兴门外三里河北街 号邮政编码：网址 电话：中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号：定价 元