SNT 2497.2-2010 进出口危险化学品安全试验方法 第2部分：空斑形成细胞(PFC)试验.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 进出口危险化学品安全试验方法第部分：空斑形成细胞（犘 犉 犆）试验犜 犲 狊 狋犿 犲 狋 犺 狅 犱狅 犳 犻 犿 狆 狅 狉 狋 犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋犱 犪 狀 犵 犲 狉 狅 狌 狊 犮 犺 犲 犿 犻 犮 犪 犾 狊犘 犪 狉 狋：犘 犾 犪 狇 狌 犲 犳 狅 狉 犿 犻 狀 犵犮 犲 犾 犾 犪 狊 狊 犪 狔 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言 进出口危险化学品安全试验方法 系列标准共分为 部分：第部分：体内哺乳动物肝细胞程序外 合成（）试验；第部分：空斑形成细胞（）试验；第部分：大型溞繁殖试验；第部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验；第部分：睾丸细胞 试验；第部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验；第部分：小鼠耳肿胀试验；第部分：腘窝淋巴结试验；第部分：血清溶血素测定试验；第 部分：淋巴细胞增殖功能测定试验；第 部分：种系突变试验；第 部分：单细胞凝胶电泳分析试验；第 部分：荧光原位杂交试验；第 部分：聚丙烯酰胺凝胶电泳试验；第 部分：实验；第 部分：实验；第 部分：哺乳动物行为毒理学试验；第 部分：加合物的检测方法；第 部分：实验；第 部分：法测定蛋白质含量；第 部分：琼脂糖凝胶电泳试验；第 部分：的 值测定方法；第 部分：细胞器的分离实验方法；第 部分：细胞免疫功能体外检测方法；第 部分：体液免疫功能试验；第 部分：巨噬细胞功能试验；第 部分：流式细胞术检测凋亡；第 部分：穿梭质粒在突变检验中的应用；第 部分：生化需氧量（）测定。本部分为 的第部分。本部分修改采用经济合作与发展组织（）化学品测试指南 空斑形成细胞试验，其有关技术内容与上述方法完全一致，在标准文本格式上按 做了编辑性修改。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。本部分主要起草人：李宁涛、王利兵、彭梓、张园、熊中强、张颖。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛 犖犜 进出口危险化学品安全试验方法第部分：空斑形成细胞（犘 犉 犆）试验范围 的本部分规定了进出口危险化学品安全试验方法空斑形成细胞试验的试验原理、试验材料、试验程序和试验结果。本部分适用于检测进出口危险化学品经一次或反复多次接触受试物后，对试验动物体液免疫功能的影响。术语和定义下列术语和定义适用于本部分。空斑形成细胞试验狆 犾 犪 狇 狌 犲 犳 狅 狉 犿 犻 狀 犵犮 犲 犾 犾 犪 狊 狊 犪 狔体外检测和计数产生 、等 抗体形成细胞的一种方法，把含有空斑形成细胞悬液与羊红细胞悬液混合，将其均匀地悬于半固体琼脂培养基或液体培养基中，在补体的参与下，在红色背景上可见到透明区，即是抗羊红细胞 空斑形成细胞。体液免疫犺 狌 犿 狅 狉 犪 犾 犻 犿犿 狌 狀 犻 狋 狔淋巴细胞在抗原的刺激下，增殖分化成浆细胞，浆细胞产生并分泌抗原特异性抗体的过程。试验原理空斑形成细胞试验（简称 试验），是检测和计数产生 、等 空斑形成细胞的一种方法，由于试验具有特异性高、筛检力强、不需要特殊的仪器设备等优点，故可作为判断外源化学物对机体体液免疫功能影响的指标。将经羊红细胞（）免疫的小鼠脾脏制成单个细胞悬液，在半固体琼脂凝胶介质中与 混合，在平皿或玻片上铺成薄层，置 温育，在有补体参与下，使分泌抗体的淋巴细胞致敏周围的 产生溶血反应，在其周围形成一个肉眼可见的透明溶血区，称为溶血斑。该方法检出的细胞主要是 空斑形成细胞。为检测分泌抗羊红细胞的 抗体形成细胞，需要加入抗 的抗体，以使羊红细胞在加入补体后溶解。材料及试剂 液、缓冲液；新鲜羊红细胞；豚鼠血清；琼脂糖（凝固点）；清洁玻片；试管；平皿；不锈钢筛网；犛 犖犜 微量取样器；恒温水浴箱；温箱；有凹槽的玻片架。试验程序 试验动物 选择健康成年小鼠，常用昆明、等品系，雌性与雄性动物均可，鼠龄在周龄周龄。动物室温度应维持在，相对湿度为 ，选用常规饲料，自由进食及饮水。剂量与分组 染毒剂量：染毒组一般设个剂量组，高剂量组为 ，低剂量组以不引起任何免疫毒性，在低、高剂量间设中剂量组。通常组间距为倍倍。按随机方法将动物分为对照组及染毒组，各组动物 只。染毒染毒途径及染毒次数依试验目的、人群接触受试物的常见途径及受试物的理化性质而定。抗原免疫 抗原免疫时间可在染毒前、染毒同时及染毒后注射抗原，视受试物对活化细胞还是静止细胞的影响而定。以羊红细胞为抗原，抗原量通常以（）个为宜。免疫途径，首选经静脉注射抗原。但染毒途径为腹腔注射时，抗原注入应选择其他途径。试验准备 抗原常以 做抗原，用消毒针头刺入羊颈静脉取血，将采集羊血放入有玻璃珠的三角瓶中，充分振摇，以脱纤维，放入冰箱保存备用，可保存周。免疫动物取保存的羊血，用生理盐水洗次，每次离心（），计数细胞并调整细胞浓度，每只鼠静脉注射（）个羊红细胞。制备补体从豚鼠股动脉放血或心脏采血，分离血清，使用前用 吸收。将压积 加入 豚鼠血清中，置于 ，中间振摇数次，离心取上清液，分装小瓶，置 冰箱保存。玻片涂膜在玻片上用刷子刷上一薄层 琼脂糖，待干后放片盒可长期保存备用。试验步骤 免疫小鼠脾细胞悬液的制备将用 免疫过的小鼠在免疫后 用颈椎脱臼法处死，取出脾脏，放在盛有 液的小平皿内。用镊子轻轻撕碎脾脏，制成单个细胞悬液，经层层纱布过滤，以除去大的组织块和结缔组织，离心（），用 液洗两遍细胞，最后将细胞悬浮在 液中，即为免疫脾细胞悬液。试验玻片制备将表层培养基（琼脂糖）加热溶解，放 水溶保温，与等量 的倍浓度 液混合。然后在水浴中分装到小试管，每管 ，再向管内加入 （用 液配制），随后加入适量的脾细胞悬液 ，充分混匀，迅速倾倒在事先用琼脂糖涂膜的玻片上，待琼脂凝固后，将玻片倒放在片架上，将装有玻片的架子小心放入特制的盒内，在 温箱中温育 。犛 犖犜 加补体取出温育过的玻片，加入用 液稀释的补体（），再在 温箱内温育，即可出现肉眼可见的溶血空斑，计数空斑。试验结果 结果处理以表格形式列出每只动物编号、性别、体重，动物处死时脾脏重、胸腺重及每张玻片上的空斑形成细胞数，计算 数 脾细胞，对染毒组与对照组动物的 数 脾细胞进行统计比较。结果评价根据染毒组与对照组 数，评价染毒组动物 数 脾细胞是否减少，以评定受试物对体液免疫功能是否有影响及影响的程度。试验报告试验报告应包括以下内容：动物品、系、来源、饲养条件、动物室环境；受试物的理化性质及配制方法、染毒时间、染毒途径；羊红细胞来源，取血时间及保存时间和条件；羊红细胞的处理及配制方法，动物免疫条件包括途径和剂量；动物处死的时间及方法；动物开始时体重、结束时体重、脾脏重、胸腺重；计数玻片上空斑，计算 数 脾细胞；统计学分析方法；结果评价。结果解释外源化学物对动物体液免疫功能的影响，多数能引起人体体液免疫功能的变化，但需要用 检测方法进行证实。犛 犖犜 书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准进出口危险化学品安全试验方法第部分：空斑形成细胞（犘 犉 犆）试验 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京复兴门外三里河北街 号邮政编码：网址 电话：中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号：定价 元