SNT 2131.1-2008 进出口贝类腹泻性贝类毒素检测方法 第1部分：荧光磷酸酶抑制法.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 进出口贝类中腹泻性贝类毒素检测方法第部分：荧光磷酸酶抑制法犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犇 犛 犘犻 狀狊 犺 犲 犾 犾 犳 犻 狊 犺犳 狅 狉 犻 犿 狆 狅 狉 狋 犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋犘 犪 狉 狋：犐 狀 犺 犻 犫 犻 狋 犻 狅 狀犿 犲 狋 犺 狅 犱狅 犳 犳 犾 狌 狅 狉 犲 狊 犮 犲 狀 犮 犲狆 犺 狅 狆 犺 犪 狋 犪 狊 犲犪 犮 狋 犻 狏 犻 狋 狔 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售书书书前言本部分是 的第部分。本部分的附录 为规范性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本部分主要起草人：吴斌、李叶、王玉萍、李振荣、谢炎。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售进出口贝类中腹泻性贝类毒素检测方法第部分：荧光磷酸酶抑制法范围 的本部分规定了贝类中定量检测腹泻性贝类毒素的荧光磷酸酶抑制检验方法。本部分适用于双壳类贝肉、贝柱中的大田软海绵酸及其衍生物的检验。缩略语下列缩略语适用于 的本部分。犇 犛 犘犱 犻 犪 狉 狉 犺 犲 犻 犮 狊 犺 犲 犾 犾 犳 犻 狊 犺狆 狅 犻 狊 狅 狀狋 狅 狓 犻 狀腹泻性贝类毒素。犗 犃犗 犽 犪 犱 犪 犻 犮犪 犮 犻 犱大田软海绵酸。犇 犜 犡 狊大田软海绵酸族衍生物。样品保存与制备 样品的保存如实验室不能立即检验，应分别用标签注明来源、取样日期、品种及编号，装塑料袋密封。抽样后样品应立即于 以下冷冻保存。样品的制备用清水彻底洗净待检贝壳，打开贝壳，彻底清洗贝壳内部，除去内部污质，取出所有贝肉组织，用滤纸尽量吸干贝肉组织的多余水分，待检贝肉组织不得少于。测定方法 方法提要本方法的测定原理是大田软海绵酸（，）及其衍生物（）的毒性与它们抑制丝氨酸和苏氨酸磷酸酶蛋白的活性直接相关，特别是 和 两种蛋白；在磷酸酶及其荧光酶作用物的微孔板实验中，大田软海绵酸及其衍生物的浓度直接决定了磷酸酶水解荧光酶作用物的能力，水解后荧光酶作用物产生荧光，然后通过荧光酶标仪读取荧光值，样品中毒素的浓度可以通过标准曲线计算得出。试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为去离子水。（体积分数）甲醇。的氢氧化钠溶液：氢氧化钠溶解于 水中，定容至 。的盐酸溶液：浓度为 （体积分数）的盐酸加入 水中，定容犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售至 。孔微孔板（）。磷酸酶溶液：见附录 第 章。大田软海绵酸标准品：，和 。荧光酶作用物：见附录 第 章。磷酸酶稀释缓冲溶液。的三（羟甲基）氨基甲烷 盐酸缓冲溶液（）：见附录 第 章。仪器和设备 微量移液器：或者 可调移液器，以及 可调移液器。旋涡混匀器。培养箱或者加热块：。荧光酶标仪：激发波长，发射波长。水浴锅：。分析天平：感量。冰箱：和 。灭菌玻璃器具：和 的量筒，容量瓶。带螺旋盖离心管。测定步骤以下过程不可以使用微孔板振荡器。提取：捣碎贝肉组织，称取到 离心管，加 浓度 的甲醇，用旋涡均质 ，在下离心 （），上清液（甲醇萃取液）倒入新离心管。水解：取 的上清液（甲醇萃取液）到另一个离心管，加 的 的氢氧化钠，密封后在 中加热 ，再加 的 的盐酸，然后加浓度为 的三（羟甲基）氨基甲烷 盐酸缓冲溶液（）直到为 ，待检。加样：准备好所需要的 孔微孔板（），建议样品和标准品都做个个平行，旋涡均质标准品后，取制备好的待检样及标准品各 分别加入相应的检测小孔；立即添加 的磷酸酶溶液（）到每个小孔；用粘胶纸密封，轻微振荡混合。孵育：在 孵育 。酶反应：加 的荧光酶作用物（）到每个小孔，用粘胶纸密封，轻微振荡混合。孵育：在 孵育 。读数：揭开密封粘胶纸，读取样品和标准品荧光光度值：激发波长：；发射波长：。结果计算与报告 计算抑制率样品和标准品的荧光值对比第个标准品（即阴性标准孔）荧光值，按式（）可以计算出样品及标准品的酶活性抑制率：抑制率（）犃犃（）（）式中：犃 样品或者标准品的荧光值；犃 阴性质控的荧光值（即 标准品）。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 标准曲线绘制在对数坐标纸上将样品、标准品的酶活性抑制率设为犡轴，大田软海绵酸浓度的对数值设为犢轴，可得到标准曲线（见图）。注：犚应大于等于 。图标准曲线 计算公式样品中 浓度（犮）可以通过上面的校准曲线计算出，也可通过式（）计算出：狔 （狓）（）式中：犡 样品的磷酸酶活性抑制率；犢 甲醇抽提溶液中 浓度（犮）；对数（）。示例：狔 （狓）结果计算根据式（）计算出样品中腹泻性贝类毒素的浓度：犮犮犉 犇犕犠犞犿（）式中：犮 组织样品中腹泻性贝类毒素的浓度，单位为微克每千克（）；犮 甲醇抽提溶液中腹泻性贝类毒素的浓度，单位为纳摩尔每升（）；犉 犇 甲醇抽提溶液稀释因子（例如：）；犕犠 大田软海绵酸的相对分子质量（），单位为克每摩尔（）；犞 甲醇抽提溶液的体积（），单位为升（）；犿 样品重量（），单位为克（）。示例：浓度的 标准品结果为：。若样品的浓度在标准区间外时（或者 ），结果则报告为 （或者 ）或者 （或者 ）。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售附录犃（规范性附录）标准试剂配制犃 磷酸酶溶液的配制此溶液配制后应立即使用，加 的磷酸酶稀释缓冲溶液（）至冻干的磷酸酶（）试剂瓶中，轻微振荡使其溶解（不可以激烈振荡，避免蛋白聚合）。在室温（）下放置 ，使磷酸酶充分水解，在任何时候都不可以使用旋涡，每瓶试剂足够 个孔使用，如果需要检测更多的样品，则需准备足够多试剂，振荡混合后一起倒入酶标槽中待用。犃 荧光酶作用物的配制加 浓度为 的三（羟甲基）氨基甲烷 盐酸缓冲溶液（）到荧光酶作用物（）试剂瓶中，混合均匀；每瓶试剂足够 个孔使用，如果需要检测更多的样品，则需准备足够多试剂，振荡混合后一起倒入酶标槽中待用。试剂应避光，可以用铝薄纸包装的容器来放置。犃 三（羟甲基）氨基甲烷 盐酸缓冲溶液（犜 狉 犻 狊 犎 犆 犾）的配制（浓度为 犿犿 狅 犾犔）取 浓度为 的 缓冲溶液（）溶解到 的水中（分别使用不同量筒），实验时保持，非实验时保持室温。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售犉 狅 狉 犲 狑 狅 狉 犱犜 犺 犻 狊狆 犪 狉 狋狑 犪 狊犛 犖犜 狆 犪 狉 狋狅 狀 犲 犜 犺 犲犪 狆 狆 犲 狀 犱 犻 狓犃狅 犳 狋 犺 犻 狊狆 犪 狉 狋狑 犪 狊狀 狅 狉 犿 犪 狋 犻 狏 犲 犜 犺 犻 狊狆 犪 狉 狋狑 犪 狊狉 犲 犾 犲 犪 狊 犲 犱狌 狆 狅 狀犪 狆 狆 狉 狅 狏 犪 犾狅 犳狋 犺 犲犌 犲 狀 犲 狉 犪 犾犃 犱 犿 犻 狀 犻 狊 狋 狉 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犙 狌 犪 犾 犻 狋 狔犛 狌 狆 犲 狉 狏 犻 狊 犻 狅 狀，犐 狀 狊 狆 犲 犮 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱犙 狌 犪 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲狅 犳 狋 犺 犲犘 犲 狅 狆 犾 犲狊狅 犳犆 犺 犻 狀 犪 犜 犺 犻 狊狆 犪 狉 狋狑 犪 狊犱 狉 犪 犳 狋 犲 犱犫 狔犔 犻 犪 狅 狀 犻 狀 犵犈 狀 狋 狉 狔 犈 狓 犻 狋 犐 狀 狊 狆 犲 犮 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱犙 狌 犪 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲犅 狌 狉 犲 犪 狌狅 犳狋 犺 犲犘 犲 狅 狆 犾 犲狊犚 犲 狆 狌 犫 犾 犻 犮狅 犳犆 犺 犻 狀 犪 犜 犺 犻 狊狆 犪 狉 狋狑 犪 狊犿 犪 犼 狅 狉犱 狉 犪 犳 狋 犲 犱犫 狔犠狌犫 犻 狀，犔 犻 狔 犲，犠 犪 狀 犵犢 狌 狆 犻 狀 犵，犔 犻犣 犺 犲 狀 狉 狅 狀 犵，犡 犻 犲狔 犪 狀 犜 犺 犻 狊狆 犪 狉 狋 犻 狊狆 狉 狅 犿 狌 犾 犵 犪 狋 犲 犱犳 狅 狉 狋 犺 犲犳 犻 狉 狊 狋 狋 犻 犿 犲 犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犇 犛 犘 犻 狀狊 犺 犲 犾 犾 犳 犻 狊 犺 犳 狅 狉 犻 犿 狆 狅 狉 狋 犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋犘 犪 狉 狋：犐 狀 犺 犻 犫 犻 狋 犻 狅 狀犿 犲 狋 犺 狅 犱狅 犳 犳 犾 狌 狅 狉 犲 狀 犮 犲狆 犺 狅 狆 犺 犪 狋 犪 狊 犲犲 狀 狕 狔 犿 犲犪 犮 狋 犻 狏 犻 狋 狔犛 犮 狅 狆 犲犛 犖犜 狋 犺 犻 狊狆 犪 狉 狋 狊 狆 犲 犮 犻 犳 犻 犲 狊 犪犿 犲 狋 犺 狅 犱 犳 狅 狉 狋 犺 犲狇 狌 犪 狀 狋 犻 狋 犪 狋 犻 狏 犲犱 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳 犱 犻 犪 狉 狉 犺 犲 犻 犮狊 犺 犲 犾 犾 犳 犻 狊 犺 狋 狅 狓 犻 狀 狊犻 狀狊 犺 犲 犾 犾 犳 犻 狊 犺狊 狆 犲 犮 犻 犲 狊狊 狌 犮 犺犪 狊犿 狌 狊 狊 犲 犾 狊，犮 犾 犪 犿 狊，狅 狔 狊 狋 犲 狉 狊犪 狀 犱狊 犮 犪 犾 犾 狅 狆 狊，犲 狋 犮 犜 犺 犻 狊狆 犪 狉 狋 狉 犲 犳 犲 狉 狊狋 狅狋 犲 狊 狋犱 犻 犪 狉 狉 犺 犲 犻 犮狊 犺 犲 犾 犾 犳 犻 狊 犺狋 狅 狓 犻 狀 狊 犻 狀 犮 犾 狌 犱 犻 狀 犵犗 犃犪 狀 犱狅 狋 犺 犲 狉犮 犪 狉 犫 狅 狓 狔 犾 犻 犮狋 狅 狓 犻 狀 狊狅 犳 狋 犺 犲犗 犃犵 狉 狅 狌 狆 犻 狀 犮 犾 狌 犱 犻 狀 犵犇 犜 犡，犇 犜 犡，犇 犜 犡 犅犪 狀 犱狋 犺 犲 犻 狉犲 狊 狋 犲 狉犳 狅 狉 犿 狊（犇 犜 犡）犻 狀狊 犺 犲 犾 犾 犳 犻 狊 犺狊 狆 犲 犮 犻 犲 狊狊 狌 犮 犺犪 狊犿 狌 狊 狊 犲 犾 狊，犮 犾 犪 犿 狊，狅 狔 狊 狋 犲 狉 狊犪 狀 犱狊 犮 犪 犾 犾 狅 狆 狊，犲 狋 犮 犃 犫 犫 狉 犲 狏 犻 犪 狋 犲 犱狑 狅 狉 犱 狊犜 犺 犲犳 狅 犾 犾 狅 狑 犻 狀 犵犃 犫 犫 狉 犲 狏 犻 犪 狋 犲 犱狑 狅 狉 犱 狊狊 犺 犪 犾 犾 犪 狆 狆 犾 狔 犻 狀犛 犖犜 狋 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱：犇 犛 犘犱 犻 犪 狉 狉 犺 犲 犻 犮狊 犺 犲 犾 犾 犳 犻 狊 犺狆 狅 犻 狊 狅 狀 犗 犃狅 犽 犪 犱 犪 犻 犮犪 犮 犻 犱 犇 犜 犡 狊 犇 犻 狀 狅 狆 犺 狔 狊 犻 狊狋 狅 狓 犻 狀 狊犛 犪 犿 狆 犾 犻 狀 犵犪 狀 犱狊 犪 犿 狆 犾 犲狆 狉 犲 狆 犪 狉 犪 狋 犻 狅 狀 犛 犪 犿 狆 犾 犲狊 狋 狅 狉 犪 犵 犲犐 犳 狊 犪 犿 狆 犾 犲 狊犮 犪 狀狋犫 犲 犻 狀 狊 狆 犲 犮 狋 犲 犱 犻 狀 犾 犪 犫 犻 狀狋 犻 犿 犲，狋 犺 犲 狔狊 犺 狅 狌 犾 犱犫 犲 犲 狀狆 狌 狋 犻 狀 狋 狅狋 犺 犲狊 犲 犪 犾 狆 狅 狌 犮 犺犪 狀 犱狋 犺 犲 狀犳 狉 狅 狕 犲 狀犪 狀 犱狊 狋 狅 狉 犲 犱犪 狋 犫 犲 犾 狅 狑 犪 犳 狋 犲 狉 狋 犺 犲 狔犪 狉 犲狀 狅 狋 犲 犱狊 狅 狌 狉 犮 犲 狊，狊 犪 犿 狆 犾 犻 狀 犵犱 犪 狋 犲，狊 狆 犲 犮 犻 犲 狊，狀 狌 犿 犫 犲 狉狑 犻 狋 犺 犾 犪 犫 犲 犾 狊 犛 犪 犿 狆 犾 犲狆 狉 犲 狆 犪 狉 犪 狋 犻 狅 狀犆 犾 犲 犪 狀狋 犺 犲狊 犺 犲 犾 犾 狋 犺 狅 狉 狅 狌 犵 犺 犾 狔狌 狊 犻 狀 犵狑 犪 狋 犲 狉；狅 狆 犲 狀狋 犺 犲狊 犺 犲 犾 犾 犳 犻 狊 犺；犪 狀 犱狑 犪 狊 犺犻 狀 狊 犻 犱 犲狋 犺 犲狊 犺 犲 犾 犾 狋 犺 狅 狉 狅 狌 犵 犺 犾 狔狋 狅犵 犲 狋 狉 犻 犱狅 犳 犪 狀 狔犱 犻 狉 狋 犚 犲 犿 狅 狏 犲 狋