SNT 2271-2009 青椒中转基因成分定性PCR检测方法.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 青椒中转基因成分定性犘 犆 犚检测方法犕 犲 狋 犺 狅 犱狅 犳 狋 犺 犲狆 犾 狅 狔 犿 犲 狉 犪 狊 犲犮 犺 犪 犻 狀狉 犲 犪 犮 狋 犻 狅 狀犳 狅 狉犱 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狀 犵犵 犲 狀 犲 狋 犻 犮 犪 犾 犾 狔犿 狅 犱 犻 犳 犻 犲 犱犮 狅 犿 狆 狅 狀 犲 狀 狋 狊 犻 狀狆 犻 犿 犻 犲 狀 狋 狅 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准青椒中转基因成分定性犘 犆 犚检测方法 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京复兴门外三里河北街 号邮政编码：网址 电话：中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号：定价 元书书书前言本标准由国家认证认可监督委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：高宏伟、梁成珠、刘心同、王岩、于立欣、曹忠雷。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛 犖犜 青椒中转基因成分定性犘 犆 犚检测方法范围本标准规定了转基因青椒中外源基因 、定性 检测方法。本标准适用于对青椒样品的转基因筛选检测，适用于抗黄瓜花叶病毒转基因青椒的鉴定。规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。基因检验实验室技术要求 植物及其加工品中转基因成分实时荧光 检测方法术语、定义和缩略语下列术语、定义和缩略语适用于本标准。术语和定义 转基因 狋 狉 犪 狀 狊 犵 犲 狀 犲将本物种不具有的、来源于其他物种的功能 序列，通过各种导入手段，使其在该物种中进行表达，以便使该物种获得新的品种特征。聚合酶链反应狆 狅 犾 狔 犿 犲 狉 犪 狊 犲 犮 犺 犪 犻 狀狉 犲 犪 犮 狋 犻 狅 狀，犘 犆 犚模板基因序列先经过高温变性成为单链，在 聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别于模板 两条链上的一段互补序列发生退火而相互结合，接着在 聚合酶的催化下以四种脱氧核糖核苷酸（）为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使欲扩增的基因片段呈几何倍数扩增。缩略语 狉 犫 犮 犔 狉 犻 犫 狌 犾 狅 狊 犲犫 犻 狊 狆 犺 狅 狊 狆 犺 犪 狋 犲 犮 犪 狉 犫 狅 狓 狔 犾 犪 狊 犲狅 狓 狔 犵 犲 狀 犪 狊 犲 犾 犪 狉 犵 犲 狊 狌 犫 狌 狀 犻 狋核酮糖，二磷酸羧化酶加氧酶大亚基基因，由植物叶绿体基因组编码。犆 犪 犕犞 犛 狆 狉 狅 犿 狅 狋 犲 狉 犳 狉 狅 犿犮 犪 狌 犾 犻 犳 犾 狅 犿 犲 狉犿 狅 狊 犪 犻 犮狏 犻 狉 狌 狊花椰菜花叶病毒 启动子。犖 犘 犜狀 犲 狅 犿 狔 犮 犻 狀狆 犺 狅 狊 狆 犺 狅 狋 狉 犪 狀 狊 犳 犲 狉 犪 狊 犲 新霉素 磷酸转移酶。犖 犗 犛 狀 狅 狆 犪 犾 犻 狀 犲 狊 狔 狀 狋 犺 犪 狊 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 狅 狉胭脂碱合成酶 转录终止子。犛 犖犜 犆犕犞 犮 狌 犮 狌 犿 犫 犲 狉犿 狅 狊 犪 犻 犮狏 犻 狉 狌 狊黄瓜花叶病毒。原理样品经过提取 后，针对转基因植物所插入的外源基因的基因序列设计引物，通过 技术，特异性扩增外源基因的 片段，根据 扩增结果，判断该样品中是否含有该转基因成分。检测先对提取的 进行内对照的扩增，扩出相应的内对照条带后可以进行筛选基因的检测，如果筛选基因为阳性，再进行鉴定基因的检测。如果筛选基因为阴性则直接报告结果。检测过程中防止交叉污染的措施按照 中的规定执行。试剂 犘 犆 犚用引物按照表中提供的引物序列合成引物，加入无离子水配成 贮存，配成直接用于 反应的 的工作液。表转基因青椒犘 犆 犚检测用的引物序列及犘 犆 犚产物的大小引物名称类型引 物 序 列片段 用途 内源 内对照 外源 筛选 外源 筛选 外源 筛选外源 鉴定 药品及试剂犜 犪 狇 聚合酶，琼脂糖（电泳纯）溴化乙锭，三氯甲烷，异丙醇，乙醇，分子量标准（），酶，饱和酚，酶。缓冲液：（），（）。缓冲液：氯化钾，硫酸铵（），硫酸镁（），（），。电泳缓冲液：，硼酸 ，（），加蒸馏水至 ；使用时 倍稀释。溴化乙锭贮存液：用双蒸水配制成 。：、。提 取 缓 冲 液：，（），氯 化 钠（），（）。仪器固体粉碎机或研钵，高速冷冻离心机，台式小型离心机，个人离心机，天平（感量 ）旋涡犛 犖犜 振荡器，仪，电泳仪，超净工作台，核酸蛋白分析仪，微量移液器，凝胶成像系统，离心管（管，），反应管（）。检测方法 样品犇 犖 犃的提取与纯化称取 样品至 离心管中，加入 提取缓冲液，涡旋振荡混匀后于 温育 ，期间颠倒混匀离心管次次。加入 的等体积三氯甲烷异戊醇，涡旋振荡混匀后放置 ，期间颠倒混匀离心管次次；犵离心 。转移上清液至 离心管中。加入 倍体积经预冷的异丙醇，于 下静置 ，犵离心 ，小心弃去上清液；加入 乙醇，期间颠倒混匀离心管次次，下 犵离心 ，小心弃去上清液；加 酶（），温育 。加入 氯化钠溶液，温浴 。加入 的三氯甲烷 饱和酚，颠倒混匀后，犵离心 ，转移上层水相至 离心管中。加入 倍体积经预冷的异丙醇，颠倒混匀后，于下静置 ；下 犵离心 ，小心弃去上清液；加入 经预冷的 乙醇，期间颠倒混匀离心管次 次，下 犵离心 ，小心弃去上清液；用经预冷的 乙醇按相同方法重复洗一次。冷冻干燥系统中挥干液体；加 缓冲液溶解 ，保存备用。犘 犆 犚扩增 实验对照的设立每个样品应有个平行实验，同时每次检测应设立个对照：分子量标准；阳性对照，为包含要检测基因片段的转基因植物材料的 或包含要检测基因片段的阳性质粒 ；阴性对照，非转基因青椒基因组 ；空白对照（不含 模板）。犘 犆 犚反应体系在 反应管中，按表所列顺序依次加入反应物，总体积为。表犘 犆 犚反应体系组成成分组 成 成 分 反应体积 缓冲液 （，含 ）引物（）引物（）犜 犪 狇 聚合酶（）酶（）氯化镁（）（）模板 （）无离子水使反应体积达到 犘 犆 犚反应程序不同外源基因的具体扩增程序见表。犛 犖犜 书书书犛 犖犜 表犘 犆 犚反应条件参数被扩增的外源基因变性扩增循环次数最终延伸 ，犘 犆 犚扩增产物的凝胶电泳检测称取 琼脂糖，于 电泳缓冲液（）中，用微波炉加热溶解琼脂糖，冷却至 左右加入溴化乙锭（）至终浓度为 ，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液（），使液面刚刚没过凝胶。将 扩增产物和加样缓冲液混合，点样。每行胶孔中选一个胶孔，在其中加入 分子量标记以判断 扩增产物大小。电压大小一般控制在 ，电泳时间约 ，或者根据溴酚蓝的移动位置来确定，电泳结果用凝胶成像仪记录并保存。结果判定 判断提取的犇 犖 犃质量使用内参照引物 扩增样品的 ，如果阴性对照、样品和阳性对照的 产物都出现 的条带，则表明提取的样品 符合 反应的要求，可以用于外源基因检测；否则不能用于检测外源基因，应该重新提取样品 。筛选基因的判定使用筛选基因的引物 、对样品 进行 扩增，如果阴性对照和空白对照未出现扩增条带，阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条带，则可以初步判断该样品含有外源基因，应该进一步进行确证实验，依照确证实验的结果最终报告。如果阴性对照和样品都未出现扩增的 产物，而阳性样品出现扩增的 产物，则可以判断待测样品中不含有该外源基因。鉴定基因判定对于青椒中转基因成分的检测，先检测 、基因。如果检测结果阴性则报告结果。如果检测结果阳性，则进行鉴定检测基因，以确定转基因青椒的为抗黄瓜花叶病毒的转基因青椒。确证实验确证实验方法按照 中规定的方法执行。犜犖犛书号：定价：元