SNT 2124-2013 大西洋鲑三代虫病检疫技术规范.pdf

SN/T2124-2013大西洋鲑三代虫病检疫技术规范1范围本标准规定了大西洋鲑三代虫病检疫时的样品采集、形态学检查、聚合酶链反应(PCR)初筛以及种类鉴定方法。本标准适用于大西洋鲑三代虫病的检疫以及流行病学调查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样3缩略语下列缩略语适用于本文件。ITS:扩增内部转录间隔区(internal transcribed spacer)COI:线粒体细胞色素氧化酶I基因(mitochondrial cytochrome C oxidase I)4病原概述大西洋鲑三代虫(Gyrodactylus salaris)是引起大西洋鲑三代虫病的一种淡水胎生寄生虫。从形态上看，大西洋鲑三代虫与同属三代虫G.teuchis(主要寄生于褐鳟、大西洋鲑和虹鳟)和G.thymalli(主要寄生于河鳟)十分相似，容易彼此混淆，具体情况参见附录A。5材料除另有规定外，所用化学试剂均为分析纯。试验用水要求达到GB/T6682中一级水的要求。5.1苦味酸铵-甘油(APG)溶液：配制方法见附录B的B.1。5.2软组织消化液、消化终止液：配制方法见B.2、B.3。5.3裂解液：配制方法见B.4。5.4引物：浓度为104mol/L,其序列如下：ITS-up:5-TTTCCGTAGGTGAACCT-3ITS-lp:5-TCCTCCGCTTAGTGATA-3CO I-up:5-TAATCGGCGGGTTCGGTAA-3CO I-Ip:5-GAACCATGTATCGTGTAGCA-35.5PCR缓冲液、dNTP、DNA聚合酶、DNA Marker、电泳上样缓冲液等，均为商品化试剂盒中成分。5.6电泳缓冲液：配制方法见B.5。SN/T2124-2013冲洗前应检查保存液和容器底部的沉淀物中是否有大西洋鲑三代虫。也可直接取乙醇保存的鱼或者鱼鳍进行镜检。检查时，可佩戴手套，将解剖镜放在具有下出风口的通风操作台上进行。8.4虫体标本制作和形态观察8.4.1操作步骤8.4.1,1加一滴水到载玻片上，然后将待检虫体放到水滴上，盖上盖玻片，用一块滤纸在盖玻片的边缘慢慢吸水，直到水基本吸干为止。8.4.1.2滴一小滴苦味酸铵-甘油(APG,见B.1)溶液到盖玻片的边缘，使其浸满盖玻片与载玻片之间的空隙。8.4.1.3在玻片上做好标签，标签上注明宿主种类、虫体的寄生部位、采集地点、采集日期和水温。8.4.1.4用生物显微镜观察玻片中虫体8.4.2形态特征为便于种类鉴定，宜用活的虫体制作标本甲醛固定的鱼，大西洋鲑三代虫标本呈白色；而乙醇固定的鱼，大西洋鲑三代虫则呈轻微的灰暗颜色。大西洋鲑三代虫属寄生虫体小而延伸，体长0.7mm,0mm。后吸器有1对中央大钩及背联结片与腹联结片各一，16个边缘小钩（参见附录C的图C.1)。其种类鉴定的依据是后吸器（即固着器）上边缘小钩、锚钩和联结棒的形态和大小（参见图C,2)在进行种类鉴定时需采用软组织消化液（见B.2)对虫体进行消化处理，只剩下硬的部位检查。消化步骤可在显微镜下进行，当观察到软组织消化完全后加人终止液见B.3)。大西洋鲑三代虫在形态上与褐鳟、大西洋鲑和虹鳟身上的G.teuchis以及河鳟身上的G.thymalli十分相似。但G.teuchis的钩镰要长而且更弯，G.thymalli的镰杆的角度要小一些。后吸器各部件形态虽相对较为固定，但大小差异较大故大小不足作为种类鉴定依据9PCR检测及鉴定9.1样品制备采用从新鲜鱼体表采集的可疑虫体。用乙醇保存的样品，去掉多余的乙醇。将虫体放在0.5mL的离心管里。加人75裂解液（见B.4),65作用20min,再95加热10mi。该裂解产品不需要进一步纯化就可以用作为PCR模板。除检测样品外，还应设立以下对照：取已知大西洋鲑三代虫样品作为阳性对照：取健康鱼组织样品作为阴性对照。9.2大西洋鲑三代虫ITS序列PCR检测方法9.2.1反应体系在PCR管内加人10缓冲液（含Mg2+)2.5L,dNTP(各2.5mmol/L)2.5L,ITS-up0.5L,ITS-lp0.5uL,rTag(5U/uL)0.5L,模板DNA2aL,ddHO将反应体系补充至25L。9.2.2反应程序95预变性5min:95，1min:55，1min:72，2min:35个循环；72，延伸7min。3