SNT 2099-2008 进出口食品中绿脓杆菌检测方法.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 进出口食品中绿脓杆菌检测方法犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犘 狊 犲 狌 犱 狅 犿 狅 狀 犪 狊 犪 犲 狉 狌 犵 犻 狀 狅 狊 犪犻 狀犳 狅 狅 犱犳 狅 狉 犻 犿 狆 狅 狉 狋 犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准的附录、附录均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：郑晶、黄晓蓉、赵贵明、翁国柱、吴芸芸、郑麟毅、陈彬、邵碧英。本标准系首次发布的出入境检验检疫标准。犛 犖犜 进出口食品中绿脓杆菌检测方法范围本标准规定了食品中绿脓杆菌的定性和定量检测方法。本标准适用于各类食品中的绿脓杆菌检测，可参考此法检测水的绿脓杆菌。规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。食品微生物学检验染色法、培养基和试剂 分析实验室用水规格和试验方法术语和定义下列术语和定义适用于本标准。绿脓杆菌属假单胞菌属（狆 狊 犲 狌 犱 狅 犿 狅 狀 犪 狊）亦名为铜绿假单胞菌，具荚膜、鞭毛，为无芽胞的革兰氏阴性杆菌，能分解蛋白质，发酵糖类能力较低，能产生两种水溶性色素：一种是绿脓菌素，为蓝绿色的吩嗪类化合物，无荧光性，另一种为荧光素，呈绿色。设备和材料 恒温培养箱：、。显微镜：带油镜头。均质器。高压灭菌器。天平：精度。全自动微生物鉴定系统或类似设备。注：是由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。吸管：，分刻度 ；，分刻度。可调移液器：，。试管：。灭菌平皿：直径，底部平整的玻璃或一次性塑料灭菌平皿。灭菌的样品处理器具：镊子、剪刀、勺子。质控菌株：绿脓杆菌标准菌株 ，恶臭假单胞菌 或其他经过验证的具有相同生物学特征的同类菌株。培养基和试剂除另有规定外，所用试剂均为分析纯，试验用水应符合 的规定。增菌液：见第 章。磷酸盐缓冲稀释液：见第 章。犛 犖犜 假单胞菌 选择性培养基：见第 章。假单胞菌 选择性培养基：见第 章。氧化酶试验：按 中 规定。乙酰胺培养基：见第 章。葡萄糖酸盐培养基：见第 章。精氨酸双水解酶培养基：见第 章。硝酸盐蛋白胨水培养基：见第 章。明胶培养基：见第 章。赖氨酸脱羧酶培养基；见第 章。营养琼脂：见第 章。测试条。测试卡。注：测试条和 测试卡是由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。检验程序 方法提要食品中绿脓杆菌的检验方法是通过选择性增菌、分离、生化鉴定等方法对食品中可能存在的绿脓杆菌进行定性和定量的检验。检验程序绿脓杆菌的检验程序见图。图绿脓杆菌检验程序示意图犛 犖犜 检验步骤 样品的存放如为冷冻样品，应于 解冻，且不超过，若不能及时检验，应置于小于 保存。非冷冻的易腐样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于冰箱保存，并在 内检验。绿脓杆菌定性检验 按无菌操作取检样（）至 增菌液中，充分摇匀，于 培养。接种 增菌培养物按 进行分离鉴定。绿脓杆菌定量检验（犕犘 犖法）无菌操作取样品（），放入灭菌均质杯或均质袋中，加 灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲稀释液，均质混匀，制成 稀释液。用 灭菌吸管吸取 稀释液 ，加入装有 灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲稀释液的广口瓶中，混合均匀，制成 稀释液。每一稀释度换取一支 灭菌吸管，按上述操作进行 倍递增稀释。根据对样品污染情况的估计，选择三个连续适宜的稀释度。每个稀释度接种三管 肉汤，每管接种。样品的最高稀释度应达到能获得阴性终点，置 培养。如有绿脓杆菌生长，培养液表面通常有一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。分离鉴定 分离培养每份增菌液用接种环分别划线接种于 平板和 平板，置 培养，观察菌落形态。绿脓杆菌在这两种平板上通常呈现圆形、平滑、湿润的黄绿色菌落，在紫外光照射下可观察到荧光。少数不形成黄绿色菌落，但有特殊芳香气味。从每个平板上挑取个可疑菌落，分别接种到营养琼脂斜面上，培养 ，取纯培养物进行鉴定。氧化酶试验挑取斜面上的纯培养物，按 中 进行氧化酶试验，绿脓杆菌氧化酶试验呈阳性。革兰氏染色挑取斜面上的纯培养物，按 中 进行革兰氏染色，绿脓杆菌为革兰氏阴性杆菌。鉴定革兰氏染色阴性、氧化酶阳性的培养物应用 测试条、生化鉴定系统或按 进行生化鉴定。乙酰胺试验挑取斜面上的纯培养物，接种到乙酰胺培养基中，置 培养，培养基不变色为阴性，红色为阳性。葡萄糖酸盐试验挑取斜面上的纯培养物，接种到葡萄糖酸盐培养基中，置 培养，加 班氏糖定性试剂，混匀，煮沸 ，冷却后观察。蓝色为阴性，黄色或砖红色沉淀为阳性。精氨酸双水解酶试验挑取斜面上的纯培养物，接种到精氨酸双水解酶培养基中，置 培养，培养基不变色为阴性，红色为阳性。犛 犖犜 硝酸盐还原产气试验挑取斜面上的纯培养物，接种到硝酸盐还原胨水培养基中，置 培养，小倒管中有气体者，即为阳性。明胶液化试验挑取斜面上的纯培养物，穿刺接种到明胶培养基中，置 培养，取出放 冰箱 ，仍呈溶解状为明胶液化试验阳性，凝固不溶为阴性。赖氨酸脱羧酶试验挑取斜面上的纯培养物，接种到赖氨酸脱羧酶培养基中，置 培养，黄色为阴性，紫红色为阳性。生长试验挑取斜面上的纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，放在 培养 ，能生长为阳性。假单胞菌属细菌生化特性特性见表。表假单胞菌属细菌生化特性生化试验绿脓杆菌荧光假单胞菌恶臭假单胞菌施氏假单胞菌氧化酶乙酰胺葡萄糖酸盐精氨酸双水解酶硝酸盐还原产气明胶液化赖氨酸脱羧酶 生长注：表示阳性；表示阴性。结果报告 定性检验结果报告：符合表中生化特性，或 和 生化鉴定为绿脓杆菌，报告样品中是否检出绿脓杆菌。定量检验结果报告：符合表中生化特性，或 和 生化鉴定为绿脓杆菌，根据每一稀释度的阳性管数差 表（见附录），计算并报告每克（毫升）样品中绿脓杆菌 值。犛 犖犜 附录犃（规范性附录）培养基犃 犛 犆 犇 犔 犘液体培养基犃 成分酪蛋白胨 大豆蛋白胨 氯化钠 磷酸氢二钾 葡萄糖 卵磷脂 吐温 蒸馏水 犃 制法将上述各成分加热煮沸至完全溶解，调节，分装适宜容器，高压灭菌 。犃 磷酸盐缓冲稀释液犃 贮存液犃 成分磷酸二氢钾 蒸馏水 犃 制法用大约 的 氢氧化钠溶液调节 至，用蒸馏水稀释至 后贮存于冰箱中。犃 稀释液用蒸馏水稀释 贮存液至 ，分装于适宜容器，高压灭菌 ，备用。犃 假单胞菌犆 犉 犆选择性培养基犃 基础培养基犃 成分蛋白胨 硫酸钾 氯化镁 十六烷三甲基溴化胺 琼脂 丙三醇 蒸馏水 犛 犖犜 犃 制法除琼脂外，将其余成分溶解于蒸馏水中，调节，加入琼脂，加热溶解，分装适宜容器，高压灭菌 ，备用。犃 犆 犉 犆添加剂犃 成分十六烷三甲基溴化胺 头孢菌素 夫西地酸 犃 制法取无菌水和无水乙醇各 混合均匀，将上述成分溶解于混合液中，摇匀，备用。犃 使用方法待基础培养基冷却至 左右，每 基础培养基加入 添加剂，倾注无菌平板。犃 假单胞菌犆 犖选择性培养基犃 基础培养基犃 成分蛋白胨 水解酪蛋白 硫酸钾 氯化镁 琼脂 蒸馏水 犃 制法除琼脂外，将其余成分溶解于蒸馏水中，调节，加入琼脂，加热溶解，分装适宜容器，高压灭菌 ，备用。犃 犆 犖添加剂犃 成分十六烷三甲基溴化胺 犃 制法取无菌水和无水乙醇各 混合均匀，将上述成分溶解于混合液中，摇匀，备用。犃 使用方法待基础培养基冷却至 左右，每 基础培养基加入 添加剂，摇匀后倾注平板。犃 乙酰胺培养基犃 成分乙酰胺 氯化钠 磷酸氢二钾 磷酸二氢钾 硫酸镁 酚红 蒸馏水 犛 犖犜 犃 制法将上述各成分加热溶解，调节，分装小试管，高压灭菌 ，备用。犃 葡萄糖酸盐培养基犃 成分蛋白胨 酵母粉 磷酸氢二钾 葡萄糖酸钾 蒸馏水 犃 制法将上述各成分加热溶解，调节，分装小试管，高压灭菌 ，备用。犃 精氨酸双水解酶培养基犃 成分酵母粉 葡萄糖 氯化钠 精氨酸 溴甲酚紫 蒸馏水 犃 制法除溴甲酚紫外，将其他成分加热溶解煮沸，调节，加入溴甲酚紫，混匀，分装小试管，高压灭菌 ，备用。犃 硝酸盐蛋白胨水培养基犃 成分蛋白胨 酵母浸膏 硝酸钾 亚硝酸钠 蒸馏水 犃 制法将蛋白胨和酵母浸膏加到蒸馏水中，加热溶解，调节，煮沸过滤后补足液量，加入硝酸钾和亚硝酸钠，溶解混匀，分装到加有小倒管的试管中，高压灭菌 ，备用。犃 明胶培养基犃 成分牛肉膏 犛 犖犜 蛋白胨 明胶 蒸馏水 犃 制法将各成分加在蒸馏水中浸泡 ，随时搅拌加热使溶解，调节，分装于试管内，高压灭菌 ，直立制成高层备用。犃 赖氨酸脱羧酶培养基犃 成分酵母粉 葡萄糖 赖氨酸 溴甲酚紫 蒸馏水 犃 制法除溴甲酚紫外，将其他成分加热溶解煮沸，调节，加入溴甲酚紫，混匀，分装小试管，高压灭菌 ，备用。犃 营养琼脂犃 成分蛋白胨 牛肉膏氯化钠琼脂 蒸馏水 犃 制法除琼脂外，将其余成分溶解于蒸馏水中，调节，加入琼脂，加热溶解，分装试管，高压灭菌 ，制成斜面备用。犛 犖犜 附录犅（规范性附录）绿脓杆菌最大可能数（犕犘 犖）检索表表 犅 接种量为 犵（犿 犔）、犵（犿 犔）、犵（犿 犔）时三管法的 犕犘 犖表阳性管数 阳性管数 注：如果接种量扩大十倍，分别为（）、（）、（）时，表中数字相应缩小十倍。如果接种量缩小十倍，分别为 （）、（）、（）时，表中数字相应扩大十倍。犛 犖犜 书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准进出口食品中绿脓杆菌检测方法 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京复兴门外三里河北街 号邮政编码：网址 电话：中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号：定价 元