SNT 2058-2008 进出口蜂王浆中氯霉素残留量测定方法 酶联免疫法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 进出口蜂王浆中氯霉素残留量测定方法酶联免疫法犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳 犮 犺 犾 狅 狉 犪 犿 狆 犺 犲 狀 犻 犮 狅 犾 狉 犲 狊 犻 犱 狌 犲 狊 犻 狀狉 狅 狔 犪 犾 犼 犲 犾 犾 狔 犳 狅 狉 犻 犿 狆 狅 狉 狋 犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋犈 狀 狕 狔 犿 犲 犾 犻 狀 犽 犲 犱 犻 犿犿 狌 狀 狅 狊 狅 狉 犫 犲 狀 狋 犪 狊 狊 犪 狔 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布前言本标准的附录为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国浙江出入境检验检疫局。本标准主要起草人：张晓峰、施伟良、朱振江、方莹、董强。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛 犖犜 进出口蜂王浆中氯霉素残留量测定方法酶联免疫法范围本标准规定了蜂王浆及冻干粉中氯霉素残留量的酶联免疫测定方法。本标准适用于蜂王浆及冻干粉中氯霉素残留量的测定。规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。分析实验室用水规格和试验方法（，：）方法提要本标准以三氯乙酸来沉淀蜂王浆中的蛋白质和提取残留的氯霉素，然后以 净化。微孔板中包被有绵羊抗兔 抗体，加入特异性抗体（兔抗氯霉素抗体）、酶标记氯霉素、氯霉素标准品或样品提取液后，特异性抗体与包被的绵羊抗兔 抗体结合，同时游离氯霉素和酶标记氯霉素竞争性的与特异性抗体结合。通过洗涤除去未结合的氯霉素和酶标记氯霉素，然后加入底物显色，用酶标仪测定吸光度，根据吸光度值得出试样中氯霉素的含量。试剂和材料除注明外，所有试剂均为分析纯，水为 规定的一级水。氯霉素检测试剂盒（参见附录）。甲醇。三氯乙酸：三氯乙酸以水溶解并定容至 。甲醇：甲醇（）以水定容至 。异辛烷三氯甲烷混合液：异辛烷、三氯甲烷以（体积比）的比例混合。小柱：（或相当产品），（）。氯霉素标准品：纯度。氯霉素标准品溶液的配制：称取 氯霉素标准品，以甲醇定容至 ，配制 的工作液，于条件下保存。空白样品：选用已确切知道不含有氯霉素的蜂王浆样品，作为空白样品。用于随样测试的加标监控实验。仪器 酶标仪。道移液器：。单道移液器：，和 。混合振荡器。犛 犖犜 高速低温离心机：。固相萃取装置。氮吹仪。具塞试管：。电子天平：。试样的制备和保存 试样的制备原始样品总量不得少于 ，蜂王浆充分搅拌均匀后，将样品分成两等份；冻干粉采用四分法，将样品分成两等份。分好的样品装入洁净容器，加封并做标识。试样的保存试样放置 条件下保存。分析步骤）提取称取 王浆样品，置于 具塞试管中，加入 三氯乙酸（），充分混匀，离心 ，取上层液备用。小柱（）依次用 甲醇（）和 水活化，取 上层液上柱，依次以 水，甲醇（）洗柱，去除残留的液体，再用 甲醇（）洗脱，将洗脱液收集于一干净试管，氮气吹干，以 样品稀释缓冲液（试剂盒提供）溶解残留物，最后加入 异辛烷三氯甲烷混合液（）萃取，离心 ，取上层水相进行分析供 检测用，最后稀释倍数为。王浆冻干粉则用水以比例稀释，充分浸泡（以上）后，称取 按照上述王浆前处理方法进行提取，最后稀释倍数为。）给出该信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对某一产品操作步骤的认可。如果其他产品的操作步骤有不同，需经实验评估后采用。测定条件 酶标仪测定条件酶标仪测定波长为 。洗板条件人工洗涤次数次以上，每次加入洗涤液量为 。自动洗板可以预定次周期。操作条件所有操作应在室温下（）进行，氯霉素试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温（）后方可使用。测定步骤 将测定需用的微孔板备齐并插入微孔架上，记录标准品及样品等在微孔架上的位置。吸取 零标准缓冲液于孔、；并吸取 零标准缓冲液于孔、；分别吸取 氯霉素标准溶液（浓度分别为：、）于孔、；吸取 样品溶液于其余微孔中。测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头。分别吸取 氯霉素酶标记物溶液于除、外的每一个微孔。分别吸取 氯霉素抗体溶液于除、外的每一个微孔。用封口膜封孔条，并持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀。将酶标板置于避光温育。倒出孔中的液体，将微孔架反扣在吸水纸上反复拍打，以除去孔中过多的残液，但不能使微孔干犛 犖犜 燥，然后，立即用洗涤缓冲液按 条件进行洗板。要注意不能使微孔干燥。迅速加入 底物溶液于每一个微孔底部，然后，持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，于 避光温育 。迅速加入 反应终止液于每一个微孔，然后，持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，将微孔架置于酶标仪中，在 处测量吸光度（应在加入反应终止液 内读取吸光度）。平行试验按以上步骤，对同一标准溶液、同一样品溶液均应进行平行试验测定。空白试验除不称取试样外，均按上述步骤进行。阳性质控每次测定均应做一个用空白样品添加氯霉素标准（）的监控样品测定，以确定实验过程的准确性。结果计算从含有标准品和待测样品的吸光度（）值中，减去空白孔、的平均 值。标准品和待测样品的 平均值除以零标准（、）的平均 值，再乘以 。计算出各标准液和样品的百分比吸光度值。零标准为 （最大百分比吸光度值），其他 值为最大吸光度值的百分数。以吸光度百分比值（犅犅）为纵坐标（），氯霉素标准溶液浓度（）对数值为横坐标，绘制标准工作曲线。从标准工作曲线上得到试样中相应的氯霉素浓度后，结果按式（）进行计算：犡犮犞 犿 （）式中：犡 样品中氯霉素的残留量，单位为微克每千克（）；犮 从标准工作曲线上得到的样品中氯霉素浓度，单位为纳克每毫升（）；犞 样品溶液的最终定容体积，单位为毫升（）；犿 样品溶液所代表的最终试样质量，单位为克（）。也可以用各种酶标仪的数据处理软件进行计算，所得结果表示至一位小数。确证试验如被测样品中为阳性结果时，应用其他方法进行确证。本方法测定低限和回收率 方法测定低限 。回收率本方法中氯霉素添加浓度及回收率的试验数据：添加量为 时，平均回收率为 ；添加量为 时，平均回收率为 ；添加量为 时，平均回收率为 。犛 犖犜 附录犃（资料性附录）氯霉素试剂盒（荷兰犈 犝 犚 犗 犇 犐 犃 犌 犖 犗 犛 犜 犐 犆 犃公司产品）犃 试剂盒组成犃 预包被抗体的 孔板：条孔。犃 氯霉素标准溶液：、和 。犃 重组零标准缓冲液。犃 氯霉素酶标记物冻干粉：根据氯霉素试剂盒中说明，可用重组零标准缓冲液配制成氯霉素酶标记物溶液。犃 抗氯霉素抗体冻干粉：根据氯霉素试剂盒中说明，可用重组零标准缓冲液配制成抗氯霉素抗体溶液。犃 底物溶液。犃 稀释缓冲液：可用水倍稀释后使用。犃 洗涤浓缩液：可用水 倍稀释后使用。犃 反应终止液。试剂盒应在避光条件下保存，溶解后的酶标记物和抗体溶液需 条件冻存。犃 标准校正曲线标准校正曲线见图。狔 狓 犚 图犃 标准校正曲线）给出该信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对某一产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，需经实验评估后使用这些等效产品。犛 犖犜 犉 狅 狉 犲 狑 狅 狉 犱犃 狀 狀 犲 狓犃狅 犳 狋 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱犪 狉 犲 犻 狀 犳 狅 狉 犿 犪 狋 犻 狏 犲犪 狀 狀 犲 狓 狊 犜 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱狑 犪 狊狆 狉 狅 狆 狅 狊 犲 犱犫 狔犆 犲 狉 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱犃 犮 犮 狉 犲 犱 犻 狋 犪 狋 犻 狅 狀犃 犱 犿 犻 狀 犻 狊 狋 狉 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳狋 犺 犲犘 犲 狅 狆 犾 犲狊犚 犲 狆 狌 犫 犾 犻 犮狅 犳犆 犺 犻 狀 犪 犜 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱 狑 犪 狊犿 犪 犻 狀 犾 狔犱 狉 犪 犳 狋 犲 犱犫 狔犣 犺 犲 犼 犻 犪 狀 犵犈 狀 狋 狉 狔 犈 狓 犻 狋犐 狀 狊 狆 犲 犮 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱犙 狌 犪 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲犅 狌 狉 犲 犪 狌狅 犳狋 犺 犲犘 犲 狅 狆 犾 犲狊犚 犲 狆 狌 犫 犾 犻 犮狅 犳犆 犺 犻 狀 犪 犜 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱狑 犪 狊犿 犪 犻 狀 犾 狔犱 犪 犳 狋 犲 犱犫 狔犉 犲 狀 犵 狓 犻 犪 狅犣 犺 犪 狀 犵，犠 犲 犻 犾 犻 犪 狀 犵犛 犺 犻，犣 犺 犲 狀 犼 犻 犪 狀 犵犣 犺 狌，犢 犻 狀 犵犉 犪 狀 犵，犙 犻 犪 狀 犵犇 狅 狀 犵 犜 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱犻 狊狆 狉 狅 犳 犲 狊 狊 犻 狅 狀 犪 犾狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱狅 犳犈 狀 狋 狉 狔 犈 狓 犻 狋 犻 狀 狊 狆 犲 犮 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱狇 狌 犪 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲狆 狉 狅 犿 狌 犾 犵 犪 狋 犲 犱犳 狅 狉狋 犺 犲犳 犻 狉 狊 狋 狋 犻 犿 犲 犛 犖犜 犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犮 犺 犾 狅 狉 犪 犿 狆 犺 犲 狀 犻 犮 狅 犾 狉 犲 狊 犻 犱 狌 犲 狊 犻 狀狉 狅 狔 犪 犾 犼 犲 犾 犾 狔犳 狅 狉 犻 犿 狆 狅 狉 狋犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋犈 狀 狕 狔 犿 犲 犾 犻 狀 犽 犲 犱 犻 犿犿 狌 狀 狅 狊 狅 狉 犫 犲 狀 狋犪 狊 狊 犪 狔犛 犮 狅 狆 犲犜 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱狊 狆 犲 犮 犻 犳 犻 犲 狊狋 犺 犲犿 犲 狋 犺 狅 犱 狊狅 犳犱 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀犫 狔犈 犔 犐 犛 犃 犿 犲 狋 犺 狅 犱狅 犳犮 犺 犾 狅 狉 犪 犿 狆 犺 犲 狀 犻 犮 狅 犾 狉 犲 狊 犻 犱 狌 犲 狊犻 狀狉 狅 狔 犪 犾 犼 犲 犾 犾 狔犪 狀 犱狉 狅 狔 犪 犾 犼 犲 犾 犾 狔狆 狅 狑 犱 犲 狉 犜 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱 犻 狊犪 狆 狆 犾 犻 犮 犪 犫 犾 犲 狋 狅狋 犺 犲狊 犮 狉 犲 犲 狀犱 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳 犮 犺 犾 狅 狉 犪 犿 狆 犺 犲 狀 犻 犮 狅 犾 狉 犲 狊 犻 犱 狌 犲 狊 犻 狀 狉 狅 狔 犪 犾 犼 犲 犾 犾 狔 狉 狅 狔 犪 犾犼 犲 犾 犾 狔狆 狅 狑 犱 犲 狉 犖 狅 狉 犿 犪 狋 犻 狏 犲狉 犲 犳 犲 狉 犲 狀 犮 犲 狊犜 犺 犲犳 狅 犾 犾 狅 狑 犻 狀 犵狀 狅 狉 犿 犪 狋 犻 狏 犲犱 狅 犮 狌 犿 犲 狀 狋 狊犮 狅 狀 狋 犪 犻 狀狆 狉 狅 狏 犻 狊 犻 狅 狀 狊狑 犺 犻 犮 犺，狋 犺 狉 狅 狌 犵 犺狉 犲 犳 犲 狉 犲 狀 犮 犲犻 狀狋 犺 犻 狊狋 犲 狓 狋，犮 狅 狀 狊 狋 犻 狋 狌 狋 犲狆 狉 狅 狏 犻 狊 犻 狅 狀 狊狅 犳狋 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱 犉 狅 狉犱 犪 狋 犲 犱狉 犲 犳 犲 狉 犲 狀 犮 犲 狊，狊 狌 犫 狊 犲 狇 狌 犲 狀 狋犪 犿 犲 狀 犱 犿 犲 狀 狋 狊狋 狅，狅 狉狉 犲 狏 犻 狊 犻 狅 狀 狊狅 犳，犪 狀 狔狅 犳 狋 犺 犲 狊 犲狆 狌 犫 犾 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀 狊犱 狅狀 狅 狋 犪 狆 狆 犾 狔 犎 狅 狑 犲 狏 犲 狉狆 犪 狉 狋 犻 犲 狊 狋 狅犪 犵 狉 犲 犲 犿 犲 狀 狋 狊犫 犪 狊 犲 犱狅 狀 狋 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱犪 狉 犲犲 狀 犮 狅 狌 狉 犪 犵 犲 犱狋 狅 犻 狀 狏 犲 狊 狋 犻 犵 犪 狋 犲 狋 犺 犲狆 狅 狊 狊 犻 犫 犻 犾 犻 狋 狔狅 犳 犪 狆 狆 犾 狔 犻 狀 犵 狋 犺 犲犿 狅 狊 狋 狉 犲 犮 犲 狀 狋 犲 犱 犻 狋 犻 狅 狀