SNT 2055-2008 豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法犐 犱 犲 狀 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳 犮 狅 狑 狆 犲 犪狊 犲 狏 犲 狉 犲犿 狅 狊 犪 犻 犮狏 犻 狉 狌 狊 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布前言本标准的附录为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：李桂芬、李明福、魏梅生、张永江、相宁、王金花。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛 犖犜 豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法范围本标准规定了豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法。本标准适用于可能带有豇豆重花叶病毒的进境种苗或繁殖材料的检疫和鉴定。原理豇豆重花叶病毒学名：，缩写：。豇豆重花叶病毒的生物学、血清学特性是本标准制定的主要依据；该病毒的分类地位、寄主范围、病害症状、地理分布、传播途径、粒体形态等参见附录。仪器和用具 仪器 酶标检测仪。天平（）。水浴锅。隔离温室。用具 可调移液器、可调移液器吸头。酶联板。管。研钵。检疫鉴定方法 豆类种子检测前的处理应将种子播种在经高温消毒过的土壤中，置隔离温室中培养并观察生长情况，待长有片片真叶时进行检测。首先选择可疑病毒症状植株进行检测，同时也要随机抽取植株样品进行检测。双抗体夹心酶联免疫吸附测定法 试材 酶联板使用质量有保障厂商生产的酶联板。包被抗体特异性好的抗豇豆重花叶病毒抗体。酶标抗体碱性磷酸酶标记的抗豇豆重花叶病毒抗体。包被缓冲液（狆 犎 ）碳酸钠（）碳酸氢钠（）叠氮化钠（）犛 犖犜 用蒸馏水定容至，储存。洗涤缓冲液（犘 犅 犛 犜、狆 犎 ）氯化钠（）磷酸二氢钾（）磷酸氢二钠（）氯化钾（）吐温 （）叠氮化钠（）用蒸馏水定容至。样品抽提缓冲液亚硫酸钠（）聚乙烯基吡咯烷酮（，）用洗液（）定溶至，储存。酶标抗体稀释缓冲液聚乙烯基吡咯烷酮（，）牛血清白蛋白（）用洗液（）定溶至，储存。底物缓冲液二乙醇胺（）蒸馏水（）用盐酸（）调 值至，然后用蒸馏水定容至，储存。实验步骤 按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体，每孔加 。酶联板加盖或用保鲜膜包好，放在 孵育。清空酶联板孔中溶液，用 加满各孔，后倒掉孔中洗涤液，在吸水纸上拍干。再重复次上述洗板过程。待检样品按（）（质量浓度）加入样品抽提缓冲液，在研钵中研磨，低速离心，吸取上清液加入到酶联板孔中（孔），每个待检样品设个重复，设阳性对照孔、阴性对照孔、缓冲液对照孔。加盖或用保鲜膜包好，冰箱孵育过夜。清空孔中溶液，先在自来水下彻底冲洗次；然后用 加满各孔，后倒掉，在吸水纸上拍干。再重复次上述用 的洗板过程。按要求的浓度用酶标抗体稀释缓冲液稀释酶标抗体，每孔加入 ，加盖或用保鲜膜包好，孵育。清空孔中溶液，先在自来水下彻底冲洗次；然后用 加满各孔，后倒掉，在吸水纸上拍干。再重复次上述用 的洗板过程。按 的浓度将对硝基苯磷酸二钠盐溶于底物溶液中（使用前配制并注意避光以防变色）制成底物溶液。每孔加入 底物溶液。加盖或用保鲜膜包好，室温避光孵育至颜色合适时读数。酶标检测仪 波长下测定各孔的吸收值。结果判定 对照孔的犗 犇 值（缓冲液孔、阴性对照孔及阳性对照孔）应该在质量控制范围内，即：缓冲液犛 犖犜 孔和阴性对照孔的犗 犇 值小于 ，当阴性对照孔的犗 犇 值小于 时，按 计算；阳性对照犗 犇 值阴性对照犗 犇 值大于；孔的重复性一致。在满足了 质量要求后，结果可判定如下：样品犗 犇 值阴性对照犗 犇 值大于或等于，判为阳性。必要时需要重复做一次酶联实验，以便排除假阳性反应，得到准确无误的结果。样品犗 犇 值阴性对照犗 犇 值小于，判为阴性。若满足不了 的质量要求，则不能进行结果判定。生物学测定 试材 鉴别寄主苋色藜（犆 犺 犲 狀 狅 狆 狅 犱 犻 狌 犿犪 犿 犪 狉 犪 狀 狋 犻 犮 狅 犾 狅 狉）、菜豆（犘 犺 犪 狊 犲 狅 犾 狌 狊 狏 狌 犾 犵 犪 狉 犻 狊）品种 、豇豆（犞 犻 犵 狀 犪狌 狀 犵 狌 犻 犮 狌 犾 犪 狋 犪）品种 。研磨缓冲液 磷酸钠缓冲液（）硅藻土。方法 研磨样品按（）（质量浓度）加入研磨缓冲液，在研钵中研碎。研碎后放入硅藻土（浓度为 ）并与病汁液混匀。接种苋色藜接种苗龄：片片真叶。菜豆（犘 犺 犪 狊 犲 狅 犾 狌 狊 狏 狌 犾 犵 犪 狉 犻 狊）品种 接种苗龄：子叶期或第一片真叶出现。豇豆（犞 犻 犵 狀 犪狌 狀 犵 狌 犻 犮 狌 犾 犪 狋 犪）品种 接种苗龄：子叶期或第一片真叶出现。先将要接种的植株叶片用牙签等穿孔作为接种叶片的标记，然后用手将样品汁液轻轻涂抹于鉴别寄主叶片上表面。冲洗用蒸馏水冲洗叶表面。标记做好标签，置于隔离温室中。隔离温室条件控制在自然光照下，温度控制在 。观察及时观察记载寄主反应。鉴别寄主症状苋色藜：接种叶出现坏死斑症状，没有系统症状。菜豆（品种 ）：接种叶出现坏死斑症状，没有系统症状。豇豆（品种 ）：接种叶出现褪绿斑症状，并且通常有红色坏死斑，有的主要叶脉变成红色和坏死，系统症状为花叶、黄脉、畸形、坏死。检疫鉴定结果判定样品酶联检测结果为阳性，生物学测定鉴别寄主反应与描述相吻合，可判定待检测样品带有豇豆重花叶病毒。犛 犖犜 样品保存种子类样品保存个月，如果发现带毒样品保存年。豆类植株中发现病毒的，采集病叶干燥后放 保存。检测原始记录、照片等文档按有关规定做好登记、标记和存档，以便必要时复核。犛 犖犜 附录犃（资料性附录）豇豆重花叶病毒的背景资料犃 分类地位豇豆花叶病毒科（），豇豆花叶病毒属（犆 狅 犿 狅 狏 犻 狉 狌 狊）。犃 寄主范围犃 自然寄主毛蔓豆（犆 犪 犾 狅 狆 狅 犵 狅 狀 犻 狌 犿犿 狌 犮 狌 狀 狅 犻 犱 犲 狊），直生刀豆（犆 犪 狀 犪 狏 犪 犾 犻 犪犲 狀 狊 犻 犳 狅 狉 犿 犻 狊），距瓣豆（犆 犲 狀 狋 狉 狅 狊 犲 犿 犪狆 狌 犫 犲 狊 犮 犲 狀 狊），菽麻（犆 狉 狅 狋 犪 犾 犪 狉 犻 犪 犼 狌 狀 犮 犲 犪），犇 犲 狊 犿 狅 犱 犻 狌 犿犮 犪 狀 犲 狊 犮 犲 狀 狊，大豆（犌 犾 狔 犮 犻 狀 犲犿 犪 狓），大翼豆（犕 犪 犮 狉 狅 狆 狋 犻 犾 犻 狌 犿犾 犪 狋 犺 狔 狉 狅 犻 犱 犲 狊），菜豆（犘 犺 犪 狊 犲 狅 犾 狌 狊狏 狌 犾 犵 犪 狉 犻 狊），四棱豆（犘 狊 狅 狆 犺 狅 犮 犪 狉 狆 狌 狊 狋 犲 狋 狉 犪 犵 狅 狀 狅 犾 狅 犫 狌 狊），绿豆（犞 犻 犵 狀 犪狉 犪 犱 犻 犪 狋 犪），豇豆（犞 犻 犵 狀 犪狌 狀 犵 狌 犻 犮 狌 犾 犪 狋 犪），犆 狉 狅 狋 犪 犾 犪 狉 犻 犪狆 犪 狌 犾 犻 狀 犲 犪。犃 试验寄主试验寄主有科科植物。豆科：木豆犆 犪 犼 犪 狀 狌 狊 犮 犪 犼 犪 狀、豌豆犘 犻 狊 狌 犿狊 犪 狋 犻 狏 狌 犿、印度麻犆 狉 狅 狋 犪 犾 犪 狉 犻 犪 犼 狌 狀 犮 犲 犪、犇 犲 狊 犿 狅 犱 犻 狌 犿犮 犪 狀 犲 狊 犮 犲 狀 狊、犛 犲 狊 犫 犪 狀 犻 犪 犲 狓 犪 犾 狋 犪 狋 犪、绛车轴草犜 狉 犻 犳 狅 犾 犻 狌 犿犻 狀 犮 犪 狉 狀 犪 狋 狌 犿、望江南犆 犪 狊 狊 犻 犪 狅 犮 犮 犻 犱 犲 狀 狋 犪 犾 犻 狊。夹竹桃科：长春花犆 犪 狋 犺 犪 狉 犪 狀 狋 犺 狌 狊 狉 狅 狊 犲 狌 狊。藜科：藜犆 犺 犲 狀 狅 狆 狅 犱 犻 狌 犿犪 犾 犫 狌 犿、苋色藜犆 犺 犲 狀 狅 狆 狅 犱 犻 狌 犿犪 犿 犪 狉 犪 狀 狋 犻 犮 狅 犾 狅 狉、犆 犺 犲 狀 狅 狆 狅 犱 犻 狌 犿犮 犪 狆 犻 狋 犪 狋 狌 犿、昆藜犆 犺 犲 狀 狅 狆 狅 犱 犻 狌 犿狇 狌 犻 狀 狅 犪。茄科：曼陀罗犇 犪 狋 狌 狉 犪 狊 狋 狉 犪 犿 狅 狀 犻 狌 犿、克里夫兰烟犖 犻 犮 狅 狋 犻 犪 狀 犪 犮 犾 犲 狏 犲 犾 犪 狀 犱 犻 犻、矮牵牛犘 犲 狋 狌 狀 犻 犪犺 狔 犫 狉 犻 犱 犪、普通烟犖 犻 犮 狅 狋 犻 犪 狀 犪 狋 犪 犫 犪 犮 狌 犿、心叶烟犖 犻 犮 狅 狋 犻 犪 狀 犪犵 犾 狌 狋 犻 狀 狅 狊 犪。苋科：千日红犌 狅 犿 狆 犺 狉 犲 狀 犪犵 犾 狅 犫 狅 狊 犪。犃 病害症状几乎所有的寄主在接种叶上形成褪绿斑或坏死斑，系统症状为斑驳或花叶，幼叶通常形成明显疱状突起、畸形。一些寄主表现系统坏死。在巴西，受侵染的大豆出现植株矮化、芽枯、结荚数减少、产量降低。毛蔓豆出现严重花叶和疱状突起；距瓣豆出现褪绿和花叶症状；菽麻叶片出现褪绿斑驳和畸形或褪绿斑症状；绿豆叶片出现轻花叶和坏死斑症状；豇豆叶片出现褪绿花叶和严重畸形。犃 地理分布美国、特立尼达（特立尼达和多巴哥共和国）、波多黎各岛、萨尔瓦多、哥斯达黎加、委内瑞拉、苏里南、巴西、秘鲁、墨西哥。犃 传播途径机械传播；花粉、种子传播；甲虫传播，主要是叶甲科甲虫传播，大 约 有 种，其 中犆 犲 狉 狅 狋 狅 犿 犪狉 狌 犳 犻 犮 狅 狉 狀 犻 狊、犆狋 狉 犻 犳 狌 狉 犮 犪 狋 犪是最重要的传播介体。犛 犖犜 犃 粒体形态豇豆重花叶病毒粒子为等轴对称二十面体，直径 ，无包膜。犛 犖犜