SNT 2021-2007 牛无浆体病检疫技术规范.pdf

SN/T2021-20074.2病原鉴定4.2.1镜检鉴定病原4.2.1.1血涂片的制备在洁净的我玻片（我玻片处理见第B.1章）三分之一处画血一小滴，以一端缘光滑的载波片为推片，将推片的端置于血滴之前，待血液沿推片端缘扩散后，自右向左推成薄血膜。理想的血膜中，红细胞星均匀分布，空气干燥的血涂片可在室温保存至少1周。若血涂片不满意，可用抗凝血来制备。与牛巴贝斯虫不同，无浆体不积聚在毛细血管，因此，从须静脉或其他大的血管采血较好。由于无浆体无特殊形态，要求血片质量要高，没有杂质，因碎片会引起误诊。厚的血涂片适宜诊断巴贝斯虫，不适宜无浆体，因为无浆体一旦与红细胞分离就很难鉴定。死亡动物应使用肝、肾、心、肺和外周血制备薄血片。脑涂片对牛巴贝斯虫的诊断是很有用的，对于无浆体无直接的诊断价值，但可以用于鉴别诊断。从组织收集血液用于制片比组织本身好，因显微镜下检查且标是完整红细胞中的无浆体。4.2.1.2血涂片染色血液或组织涂片，用姬姆萨染色进行镜检是最常用的鉴定无浆休方法。血液或组织涂片先用无水甲醇厨定】min,用10%姬姆萨（配制方法见第B.2章）染色30min。染色后涂片用自来水冲洗3次4次，以除去附着的染料，但不要超过5s,否则样本会脱色，然后空气干燥。4.2.1.3显微观察在显微镜下先以低倍镜(1010)观察血涂片，调节视野，然后以油镜(10100)观察。无浆体是寄生在红细胞内的一种例球形生物，只有一个染色质团，无细胞浆，故称无浆体。在姬姆萨染色的涂片中，无浆体在红细胞内为致密、圆形、深染的紫红色小体，直径约0.3m1.0m。边缘无浆体大多数位于或接近红细胞的边缘（见图1，俯头所指的小圆点为边缘无浆体，大的为红细胞）。这个特征可区分边缘无浆体和中央无浆体，后者大多数更接近红细胞的中央。红细胞感染的百分率因疾病的不同阶段和严重程度不同。边缘无浆体的最大感染举可以超过50%。在严亚的菌血症期，多个无浆体感染一个红细胞是很普遍的。感染后2周一6周显微镜下可见菌体。在发病期间，红细胞染菌率几乎随天数成倍提高，持续大约0d。然后，以同样的速度下降。血液涂片查不出菌体后，严重的贫血还会持续几周。初次感染康复后，大多数牛终身隐性感染。因此，涂片检测适用于急性感染期。图1姬姆萨染色边缘无浆体(10100油镜)4.2.2套式PCR检测鉴定病原4.2.2.1原理无浆体主要的表面蛋白有六种，分别为MSP1a、MSP1B、MSP2、MSP3、MSP4、MSP5。MSP4和MSP5高度保守。根据编码无浆体MSP4基因序列MSP4的保守区，设计了针对边缘无浆体(A.mar2