SNT 2074-2008 主要食用菌中转基因成分定性PCR检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 主要食用菌中转基因成分定性犘 犆 犚检测方法犘 狉 狅 狋 狅 犮 狅 犾 狅 犳 狋 犺 犲狇 狌 犪 犾 犻 狋 犪 狋 犻 狏 犲狆 狅 犾 狔 犿 犲 狉 犪 狊 犲 犮 犺 犪 犻 狀狉 犲 犪 犮 狋 犻 狅 狀（犘 犆 犚）犳 狅 狉犱 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狀 犵犵 犲 狀 犲 狋 犻 犮 犪 犾 犾 狔犿 狅 犱 犻 犳 犻 犲 犱犮 狅 犿 狆 狅 狀 犲 狀 狋 犻 狀犳 犪 犿 犻 犾 犻 犪 狉犲 犱 犻 犫 犾 犲 犳 狌 狀 犵 犻 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布前言本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局。本标准主要起草人：陈文炳、邵碧英、江树勋、李寿崧、朱晓南、郭立新、杨婕。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛 犖犜 主要食用菌中转基因成分定性犘 犆 犚检测方法范围本标准规定了主要食用菌中转基因成分检验的抽样、制样、定性 检测方法。本标准适用于对主要食用菌（杏鲍菇、红菇、姬松茸、香菇、草菇、牛肝菌、鸡腿菇、金针菇、双孢蘑菇、猪肚菇、凤尾菇、小平菇、秀珍菇、猴头菇、金顶侧耳、茶树菇、竹荪、黑木耳、白木耳等）中转基因成分的检测。规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。分析实验室用水规格和实验方法（，：）植物及其加工产品中转基因成分实时荧光 定性检验方法缩略语下列缩略语适用于本标准。犖 犗 犛 狀 狅 狆 犪 犾 犻 狀 犲 狊 狔 狀 狋 犺 犪 狊 犲犵 犲 狀 犲 犳 狉 狅 犿犃 犵 狉 狅 犫 犪 犮 狋 犲 狉 犻 狌 犿狋 狌 犿 犲 犳 犪 犮 犻 犲 狀 狊来源于根癌农杆菌的胭脂碱合成酶基因。犅 犃 犚狆 犺 狅 狊 狆 犺 犻 狀 狅 狋 犺 狉 犻 犮 犻 狀犪 犮 犲 狋 狔 犾 狋 狉 犪 狀 狊 犳 犲 狉 犪 狊 犲犵 犲 狀 犲 犳 狉 狅 犿犅 犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊 犪 犿 狔 犾 狅 犾 犻 狇 狌 犲犳 犪 犮 犻 犲 狀 狊来源于杆菌犅 犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊 犪 犿 狔 犾 狅 犾 犻 狇 狌 犲犳 犪 犮 犻 犲 狀 狊草丁膦乙酰转移酶基因。犌 犝 犛 犵 犾 狌 犮 狌 狉 狅 狀 犻 犱 犪 狊 犲犵 犲 狀 犲葡糖醛酸酶基因（作为植物基因表达的报告基因）。犖 犘 犜狀 犲 狅 犿 狔 犮 犻 狀 狆 犺 狅 狊 狆 犺 狅 狋 狉 犪 狀 狊 犳 犲 狉 犪 狊 犲犵 犲 狀 犲来自大肠杆菌 菌株的新霉素 磷酸转移酶基因。犛 狉 犇 犖 犃编码 （核糖体）的。原理样品经过提取 后，针对转基因食用菌所导入的常见外源基因的基因序列设计引物，通过 技术，对外源基因的 片段进行特异性扩增，根据实验结果，判定该食用菌样品是否含有外源基因成分。犛 犖犜 试剂和材料除另有规定外，所使用的试剂为分析纯或生化试剂，水为按照 规定的一级水。缓冲液：，（），（）。饱和酚或水饱和酚。三氯甲烷。异戊醇。异丙醇。无水乙醇。乙醇。溶液（，）。（）。蛋白酶（）。琼脂糖：电泳纯。三羟甲基氨基甲烷（）。氯化钠溶液（）。（）：乙二胺四乙酸。缓冲液（含 氯化镁）。溶液：，各 。犜 犪 狇 聚合酶。引物：检测转基因食用菌内、外源基因的引物序列及相关信息见表。表犘 犆 犚引物与犘 犆 犚产物基因名称基因来源引物序列扩增长度 退火温度提示 内源 外源 终止子 外源 目的基因 外源 报告基因 外源 标记基因 研究转基因食用菌用的阳性质粒 ，含有终止子、香菇三磷酸甘油醛脱氢酶（）基因启动子、目的基因、报告基因 等元件，从中提取 溶液。溴化乙锭（）：。分子量标准。缓冲液：，硼酸 ，（）加蒸馏水至 。加样缓冲液（电泳前沿指示剂）：溴酚蓝，二甲苯青，甘油水溶液（或 蔗糖）。犛 犖犜 离心管：，两种规格，用前须高压灭菌处理。反应管：，用前须高压灭菌处理。仪器设备 研钵或电动研磨器。恒温水浴锅或干式恒温器：恒温范围为室温 ，精度为。电子天平：感量为 与 。台式高速离心机，低温冷冻高速离心机，小型瞬时离心机。高温干燥箱。冷冻、冷藏冰箱。制冰机。旋涡振荡器。高压灭菌锅。计。微量移液器：体积范围为 ，枪头用前应高压灭菌处理。浓缩仪。核酸蛋白分析仪。纯水机。超净工作台或生物安全柜。仪。微波炉。电泳仪。电泳槽。凝胶分析成像系统。测定方法 犇 犖 犃的抽提及浓度测定 犇 犖 犃的提取称取约 烘干后的食用菌样品，经干热灭菌（干热处理）或 、高压消毒处理的研钵或在粉碎机中研磨成颗粒大小约 左右的粉末，备用。称取 烘干后研磨成粉的样品于 的离心管中，加 缓冲液，蛋白酶（），（），剧烈振荡 以上，温浴，期间定期振荡。加 水饱和酚三氯甲烷异戊醇（），剧烈振荡，犵离心 。取上清液，再加等体积的水饱和酚三氯甲烷异戊醇（），振荡混匀，犵离心 。取上清液，加 倍体积异丙醇，混匀，犵离心 。取沉淀，加入 氯化钠（）于 温浴中溶解，加等体积的水饱和酚三氯甲烷异戊醇（），振荡，犵离心 。取上清液，加倍体积的无水乙醇，轻微振荡，犵离心 。取沉淀，乙醇清洗次，干燥，加 （）溶解。每个样品设个重复。也可使用市售的应用于真菌 提取的试剂盒。犇 犖 犃的浓度与纯度测定 方法样品 用核酸蛋白分析仪测定 和 处吸收值，分别计算 纯度与浓度，纯度等于 ，比值在 之间较为理想。双链 浓度（）等于 倍 值。犛 犖犜 方法通过真核生物共有的核糖体 基因的 扩增结果，判定从样品中提取的 是否适合于 检测，测试步骤按 规定的方法。定性犘 犆 犚检测 犘 犆 犚反应体系检测食用菌中的内源 基因与外源基因采用的 检测体系见表。每个样品反应体系设个重复（同时做管）。表定性犘 犆 犚检测参考反应体系试剂名称储备液浓度 反应体系加样量 反应体系加样量 缓冲液（含 氯化镁）犜 犪 狇酶 正向引物反向引物 模板 双蒸水（）补至 补至 犘 犆 犚反应体系对照的设置进行 检测时设立置阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照：转基因食用菌的阳性质粒或转基因食用菌中提取的。阴性对照：非转基因食用菌中提取的。空白对照：用配制反应体系的实验用水代替模板。犘 犆 犚反应热循环参数的设置 预变性 。变性，退火，延伸 ，个循环。延伸 。下保存。也可根据不同的基因扩增仪对 反应热循环参数做相应的调整。犘 犆 犚扩增产物的电泳检测用 电泳缓冲液制备的琼脂糖凝胶。将 的 扩增产物分别与的加样缓冲液（电泳前沿指示剂）混合后，在凝胶板上的孔中点样。用分子量大小适当的 做分子量标记。选择合适的电压（），电泳时间为 。用凝胶成像仪观察、拍照、记录与分析。结果判断 样品犇 犖 犃抽提质量判断按照真核生物共有的核糖体 基因的序列设计的引物，对食用菌阴性样品与待测样品的 提取液进行 扩增。均应扩增出 的片段，否则，说明提取的 质量有问题，或者是 溶液中存在 反应的抑制因子，应该重新纯化或提取，直至扩增出该 片段，防止检测中产生假阴性结果。外源基因的检测如果阴性对照与空白对照未扩增出 片段，阳性对照扩出预期的 片段，待测样品未扩增出预期的 片段，可以断定待测样品中不含有外源基因，如果扩出预期的 片段，则可初步判定犛 犖犜 待测样品中含有可疑的外源基因，应进一步进行确证实验。结果确证实验与结果表述 方法实时荧光犘 犆 犚检测方法待测样品外源基因 扩增阳性结果的，按照 中规定的方法执行。方法犘 犆 犚扩增产物的犇 犖 犃测序方法外源基因 扩增阳性结果的，可委托有资质的生物技术公司对扩增产物进行测序，所获得的序列与已知的该外源基因相应序列进行比对加以确证。注：可根据实验室条件任选一种方法进行确证。结果表述经 或 确证为阳性的，表述为：检出基因；确证为阴性的，表述为：未检出基因。样品保存 保存条件干燥样品保存在常温下，新鲜样品保存于 下。保存期限保存期限为个月。犛 犖犜