SNT 2014-2007 番茄黑环病毒检疫鉴定方法.pdf

书书书?中华人民共和国出入境检验检疫行业标准?番茄黑环病毒检疫鉴定方法?发布?实施中华人民共和国国家质量技术监督检验检疫总局发 布书书书前?言?本标准的附录?附录?为规范性附录?附录?附录?为资料性附录?本标准由认证认可监督管理委员会提出并归口?本标准起草单位?中华人民共和国天津出入境检验检疫局?中华人民共和国上海出入境检验检疫局?本标准主要起草人?夏惠娟?杨翠云?刘勇?郭京泽?刘鹏?廖芳?罗加凤?于翠?本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准?番茄黑环病毒检疫鉴定方法?范围本标准规定了番茄黑环病毒检疫鉴定的方法?本标准适用于所有进出境活体植物材料?包括无性繁殖材料?组培苗?种子和苗木中番茄黑环病毒的检疫鉴定?术语和定义下列术语和定义适用于本标准?双抗体夹心酶联免疫吸附测定在固相支持物上?酶联板?包被病毒特异性抗体?加入待测样品后?再用酶标记的病毒抗体进行免疫识别?最后通过酶促化学反应检测病毒是否存在的一种血清学检测方法?利用反转录酶将病毒?反转录为?并以耐热?聚合酶和一对引物?与待测目标核酸分子序列同源的?片段?通过高温?分子变性?和低温?引物和目标核酸分子复性并被耐热?聚合酶延伸?交替循环扩增待测目标核酸分子的方法?原理番茄黑环病毒学名?缩写?分类地位?豇豆花叶病毒科?线虫传多面体病毒属?该病毒主要通过介体传播?线虫?和?机械传播?种子?繁缕和大豆等?传播?也可通过无性繁殖材料的运输等进行长距离传播?该病毒粒体为等轴多面体病毒?直径约为?该病毒基因组含两条?长?长?英国血清型?和?德国血清型?该病毒的血清学?生物学?分子生物学和粒体形态等特性是鉴定该病毒的依据?仪器设备和设施?用具和试剂?仪器设备酶标仪?电子天平?仪?电泳仪?电泳槽?凝胶成像系统?透射电子显微镜?微量榨汁机?水浴锅?低速离心机?转速为?生物培养箱?具有光照条件?温度可控制范围为?高速冷冻离心机?超低温冰箱?设施隔离温室?用具可调式微量移液器?及相应的移液器吸头?酶联板?管?研钵?计或各范围的?试纸条?量筒?封口膜?吸水纸?白瓷盘及镊子等?试剂酶联反应检测试剂?见附录?摩擦接种检测试剂?参见附录?免疫电镜检测试剂?参见附录?检测试剂?见附录?病毒检测采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法?见附录?摩擦接种检测方法?参见附录?免疫电镜检测方法?参见附录?检测方法?见附录?进行检测?结果判定?样品酶联检测结果为阴性?检测也为阴性?判定为不携带番茄黑环病毒?样品酶联检测为阳性?出现任何一种下列情况?均可判定为携带番茄黑环病毒?检测为阳性?摩擦接种检测?鉴别寄主反应与附录?描述相符合?电镜下观察到符合附录?所描述的病毒粒子形态?样品酶联检测为阳性?出现下面任一情况?判定为不携带番茄黑环病毒?检测为阴性?摩擦接种检测?鉴别寄主反应与附录?描述不符合?样品在电镜下未观察到符合附录?所描述的病毒粒子形态?样品保存和复核?样品保存经检验确定携带番茄黑环病毒的样品应保存在适合的条件下以备复核?如种子保存在干燥条件下?其他情况的取实验样品保存在?冰箱中?有条件的保存在?冰箱中更好?做好登记和标记工作?结果记录与资料保存记录包括?样品来源?种类?取样人员?实验的时间?地点?方法和结果?检验检疫员的签字等?酶联免疫吸附测定法检测应有酶联板反应的数值?生物学测定应有鉴别寄主的症状照片?免疫电镜应有病毒粒子的图片?检测应有电泳结果照片?结果复核由国家质量监督检验检疫总局指定的单位和人员进行复核?考察实验记录?数据或图片等资料的完整性和真实性?必要时进行复核实验?附?录?规范性附录?双抗体夹心酶联免疫吸附测定方法?试剂?缓冲液?将氯化钠?磷酸二氢钾?磷酸氢二钠?氯化钾?叠氮钠?吐温?溶于?的蒸馏水中?用浓盐酸?调节?至?并定容至?样品抽提缓冲液?将亚硫酸钠?聚乙烯基吡咯烷酮?叠氮钠?吐 温?溶 于?的?中?用?调 节?至?定 容至?包被抗体缓冲液?将碳酸钠?碳酸氢钠?叠氮钠?溶解于?蒸馏水中?用浓盐酸?调节?至?并定容至?洗涤缓冲液?缓冲液?用浓盐酸?调节?至?酶标抗体缓冲液?将?缓冲液?小牛血清蛋白?叠氮钠?用无菌蒸馏水定容至?底物?缓冲液?将二乙醇胺?叠氮钠?溶解于?的无菌蒸馏水中?用浓盐酸?调节?至?然后用蒸馏水定容至?底物?溶液将对?硝基苯磷酸钠?溶解于?缓冲液中?浓度?根据实际需要现配现用?并注意避光以防止变色?反应终止液氢氧化钠?溶于?的无菌蒸馏水中?浓度?种子表面消毒液将?的次氯酸钠?溶解于?的蒸馏水中制成浓度为?的消毒液?生物制剂采用番茄黑环病毒检测试剂盒?注?未作特殊说明?所使用试剂均为分析纯?上述缓冲液在?条件下至少可保存?月以上?使用前将溶液温度恢复于室温使用?检测方法?样品制备?种子类将应检测种子经?次氯酸钠?表面消毒?后?用无菌水洗涤三次?将种子置于铺有吸水纸的白瓷盘中?在适宜的发芽温度?条件下催芽?直至长出第一对真叶作为检测样品?用?微量榨汁机或研钵研磨样品?样品重量和抽提缓冲液体积比为?制备的汁液按照批号分别盛于?管中瞬时离心后吸取上清液待用?鳞球?块?茎类将鳞球茎或块茎芽眼?处于休眠状态的要打破休眠?在生物培养箱中催芽?直至长出叶片?随机抽取生长叶片或直接用解剖刀切取鳞球茎上的鳞片组织作为样品?用微量榨汁机或研钵研磨样品?样品重量和抽提缓冲液体积比为?制备的汁液按批号分别盛装于?管中?瞬时离心后吸取上清液待用?种苗类对同一批号的植株叶片进行随机取样?用微量榨汁机或研钵研磨样品?植物组织重量和抽提缓冲液体积比为?制备的汁液分别盛装于?管中低速离心后吸取上清液待用?检测?根据检测需要设计?孔?或?孔?酶联板?包括?个阳性对照孔?个阴性对照孔?个空白对照孔和多个待检测样品孔?待测样品孔重复两次?每孔加入?的?的包被抗体溶液?封口膜包好?孵育?或?冰箱过夜?控干酶联板中溶液?用?的?洗涤液洗涤酶联板?次?每次?然后在干净毛巾或滤纸上扣干?将?待检测样品液?中制备的样品?加入到设计的待检测孔中?对照孔中也各加入?相应的阴性对照?阳性对照和空白对照?封口膜包好?孵育?或?冰箱过夜?控干孔中溶液?用?洗涤?步骤与?的要求相同?用酶标抗体稀释缓冲液按照要求稀释酶标抗体?每孔加入?酶标抗体溶液?封口膜包好?并于?孵育?洗涤?步骤同?的要求相同?将?溶于底物缓冲液中?使最终浓度为?每孔加入?配好的底物溶液?室温孵育?必要时每孔加入?的?氢氧化钠溶液终止反应?用肉眼观察判断酶联板颜色反应结果或者用酶标仪分别在?时检测?质量控制要求和结果判定?质量控制要求满足以下条件时?判定检测结果有效?空白对照孔和阴性对照孔的?值小于?阳性对照?阴性对照?在?之间?重复检测样品?值平均允许率?小于?如阴性对照孔的?值小于?时?在判定时都按?计算?平均允许率按照式?计算?式中?平均允许率?重复样品?重复样品?结果判定在满足?的质量要求后?按如下原则作出判定?样品?阴性对照?值大于?结果判定为阳性?样品?阴性对照?值等于?判定为可疑?需重做一次或者用其他方法进行验证?样品?阴性对照?值小于?判定为阴性?附?录?资料性附录?摩擦接种检测方法?鉴别寄主采用昆诺藜?或苋色藜?黄瓜?菜豆?矮牵牛?番杏?黄花烟?普通烟?包括白肋烟?和三生烟?克利夫兰烟?为鉴别寄主植物?试剂?磷酸盐缓冲液?金刚砂?检测方法?研磨病样加上?的磷酸盐缓冲液?在研钵中研碎?接种将金刚砂加入病样汁液中?接种鉴别寄主?冲洗用自来水冲洗接种过的叶子表面?标记做好标签?记上接种病毒种类?时间等?观察在隔离温室中?每天观察并记录寄主的反应?结果判定依据寄主的反应症状进行判定?符合以下症状的则判定为阳性?昆诺藜或苋色藜?后?接种叶出现局部褪绿斑?然后出现系统褪绿斑驳?黄瓜?后?接种子叶出现局部退绿斑或小型坏死环斑或黄斑?后出现系统环线脉?畸形?菜豆?后接种叶出现局部褪绿?坏死或畸形?矮牵牛?接种叶出现局部枯斑或坏死环斑?然后出现系统褪绿环斑或线纹或明脉?番杏?接种?后接种叶出现细轮纹?后出现环斑?黄花烟?接种后接种叶产生局部褪绿或坏死斑或环?普通烟的白肋烟或三生烟?接种后接种叶产生局部坏死环和斑点?系统斑点?环或者线条斑?克利夫兰烟?接种后接种叶产生局部环斑?附?录?资料性附录?免疫电镜检测方法?试剂?乙酸双氧铀染液?将?乙酸双氧铀溶解于?无菌蒸馏水中?定容至?现配现用?检测方法?取经?检测后呈阳性反应的植株叶片?用微量榨汁机或研钵研磨样品制备提取液?离心后取上清液?将铜网?膜?膜面浸在一滴适量稀释浓度?的病毒抗血清上?室温下?孵育?用滴管滴?滴?洗液于铜网上?洗涤?将包被了病毒抗血清的铜网浮在样品提取液上?室温孵育?后?洗涤同?将洗涤后的铜网浮在新配制的?乙酸双氧铀上?经吸水纸完全吸去染色液干燥后?在透射电镜下进行观察?结果判定在电镜下观察到直径约为?的等轴多面体病毒粒体?即可判定为阳性?附?录?规范性附录?检测方法?试剂?核酸提取试剂为商品化?试剂?冰乙酸?用时加蒸馏水稀释至?检测方法?核酸提取?取?样品?液氮研细?加入?混匀?倒入?离心管中?加入?三氯甲烷?猛烈振荡?离心?小心吸取上层无色水相到新离心管中?加入等体积异丙醇?混匀?静置?离心?保留沉淀?加入?冷乙醇?悬浮沉淀?离心?干燥沉淀?加入?水?溶解沉淀?必要时可于水浴?加速溶解?存于?备用?引物设计根据已报道的?基因的保守序列设计特异性引物?序列为?预期扩增片段大小为?反转录反转录体系?反向引物?模板?反应?冰上放置?加入?的?酶?的?反转录酶?酶抑制剂?反应?扩增反应体系?其中?反转录产物?缓冲液?氯化镁?下游引物?上游引物?酶?和?水?反应条件?个循环?延伸?琼脂糖凝胶检测?制备凝胶用?配制?琼脂糖凝胶?加热溶化后冷却至?左右?加溴化乙锭将溴化乙锭?加入到配制好的凝胶中?浓度为?将凝胶倒入凝胶槽中?插上样品梳子?冷却凝固后拔掉梳子?在电泳槽内加入?缓冲液要没过凝胶表面约?加样将加样缓冲液与样品混合后加入样品孔?同时设计?的阴性对照和阳性对照?并加入分子量标准物?电泳接通电源?以?电场强度进行电泳?后观察结果?结果观察电泳结束后?将整个凝胶置于凝胶成像系统上观察?记录结果?结果判定通过观察?若样品和阳性对照在?处均有条带出现?阴性对照不出现条带?即可判定为阳性?书书书?中华人民共和国出入境检验检疫行?业?标?准番茄黑环病毒检疫鉴定方法?中 国 标 准 出 版 社 出 版北京复兴门外三里河北街?号邮政编码?网址?电话?中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷?开本?印张?字数?千字?年?月第一版?年?月第一次印刷印数?书号?定价?元