SNT 1467-2020 小鹅瘟检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 14672020代替 SN/T 14672004小鹅瘟检疫技术规范Quarantine protocol for goose parvovirus2020-12-30 发布2021-07-01 实施ICS 11.220CCS B 41中华人民共和国海关总署发 布SN/T 14672020I前 言本文件按照 GB/T 1.12020 给出的规则起草。本文件替代 SN/T 14672004小鹅瘟病毒分离和琼脂免疫扩散试验方法。本文件与 SN/T 14672004 相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下：增加聚合酶链反应（PCR）方法。修订了附录 A，增加了附录 B、附录 C 和附录 D。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国南京海关。本文件主要起草人：罗朝科、徐晔、唐泰山、李超美、朱雪良、刘学辉、王成龙、段宏安、周毅、王凤芝、丁超。本文件所代替文件的历次版本发布情况为：SN/T 146720041SN/T 14672020小鹅瘟检疫技术规范1 范围本标准规定了小鹅瘟病毒的临床诊断、病毒分离试验、琼脂免疫扩散试验和聚合酶链反应（PCR）等技术要求。本标准适用于禽类及其产品中小鹅瘟病毒的出入境检疫。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4 临床诊断小鹅瘟简介参见附录 A，小鹅瘟的发病症状与病理变化参见附录 B。5 实验室诊断5.1 样品采集5.1.1 对死亡或濒死动物，无菌采取肝、胰、脾、肾、脑等样品。对活动物，采集全血。对动物产品，采集内脏、组织。5.1.2 样品的采集和包装应采用无菌器具，采集后应密封、冷藏并立即运送到实验室。5.1.3 样品用含抗生素的 pH 7.0 7.4 磷酸盐缓冲液（PBS）（配制方法见附录 C）制成 10%20%的悬浮液，4 3 000 r/min 离心 10 min，取上清液经 0.22 m 滤膜过滤除菌。采集或处理的样品在 2 8 条件下保存不超过 4 d，若需长期保存，应放置-70 冰箱，但应避免反复冻融。5.2 病毒分离试验5.2.1 试剂青霉素（工作浓度 10 000 IU/mL）；链霉素（工作浓度 10 000 IU/mL）；9 日龄 11 日龄 SPF 鹅胚。2SN/T 146720205.2.2 主要设备生物安全柜；离心机；恒温培养箱；微量可调移液器。5.2.3 试验程序5.2.3.1 鹅胚接种吸取经过滤除菌的样品处理液，经尿囊腔接种至少 5 枚 9 日龄 11 日龄的 SPF 鹅胚，0.2 mL/枚，35 37 孵育 4 d7 d。接种后每天检查鹅胚生长情况。5.2.3.2 病毒收获收集 18 h 以后的死胚以及培养结束时存活的鹅胚，置冰箱 4 致冷 4 h24 h，无菌采集尿囊液。5.2.4 病毒鉴定使用琼脂扩散试验或聚合酶链反应（PCR）进行小鹅瘟病毒鉴定。5.3 琼脂免疫扩散试验5.3.1 试剂和材料5.3.1.1 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。5.3.1.2 琼脂板（配制方法见附录 C）。5.3.1.3 小鹅瘟病毒阳性血清（由指定单位提供）。5.3.1.4 小鹅瘟病毒阴性血清（由指定单位提供）。5.3.1.5 小鹅瘟病毒标准抗原（由指定单位提供）。5.3.2 主要设备微量可调移液器，酒精灯，37 恒温箱。5.3.3 检测抗体5.3.3.1 被检血清制备按常规方法采血分离血清。应无溶血，无细菌污染。保存于 4。5.3.3.2 被检鹅卵卵黄处理被检鹅卵黄的处理用注射器（不带针头）吸取 20 mL 新鲜鹅卵黄于离心管中，加入等量生理盐水充分振荡均匀，再加入 20 mL 三氯甲烷振荡 30 min 后，以 3 500 r/min 离心 30 min，取上清液（约 20 mL）装入透析袋内，置 40%聚乙二醇中浓缩（约 6 h12 h）至 1 mL2 mL，吸出浓缩液并用1 mL 2 mL 生理盐水洗透析袋，吸出合并于浓缩液中，控制最终浓缩倍数 5 倍。最后以 3 500 r/min离心 30 min，取上清液加入 0.01%硫柳汞，冻结保存（-20）待检。5.3.3.3 打孔反应孔现用现打。在制备的琼脂板上，按照图 1 打孔，孔径约 5 mm，孔距 2 mm5 mm。将孔中3SN/T 14672020的琼脂用针头轻轻挑出或吸出，勿伤边缘，以免渗漏。图 15.3.3.4 封底用酒精灯轻烤平皿或玻璃板底部，封闭孔的底部，以防侧漏。5.3.3.5 加样用微量移液器吸取抗原悬液加到 G 孔中，阳性血清对照加入+孔中，被检血清或卵黄上清液按照顺序分别加入其余各孔中，每孔均以加满不溢为度。每加一个样品换一个吸头。5.3.3.6 作用加样完毕后，静置 10 min，然后将平皿水平倒置或玻璃板水平正置放入湿盒内，放入湿盒于室温22 25 下作用 48 h72 h，分别于 24 h、48 h 和 72 h 观察并记录结果。5.3.3.7 结果判定5.3.3.7.1 在暗背景下，将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，若标准阳性血清与抗原孔之间出现一条清晰致密的白色沉淀线，则试验成立，否则视为无效，需重做。5.3.3.7.2 若被检血清孔与中心抗原孔之间出现沉淀线，并与标准阳性血清的沉淀线末端相吻合，则被检血清判为阳性（如图 1 所示 1 号孔）。5.3.3.7.3 若被检血清孔与中心抗原孔之间不出现沉淀线，但标准阳性血清的沉淀线一端弯向被检血清孔（如图 1 所示 3 号孔），则此孔的被检血清判为弱阳性（凡弱阳性者应重复试验，仍未弱阳性者，判为阳性）。5.3.3.7.4 若被检血清孔与中心抗原孔之间不出现沉淀线且标准阳性血清的沉淀线直向被检血清孔或向其外侧偏弯者（如图 1 所示 2 号孔），则被检血清判为阴性。5.3.3.7.5 若被检血清孔与中心抗原孔之间的沉淀线与标准阳性血清和抗原孔之间的沉淀线交叉直伸（如图 1 所示 4 号孔），则判为非特异性反应，应重复该试验。若仍出现非特异性反应则判为阴性。5.3.4 检测抗原5.3.4.1 抗原制备从鹅胚中取出绒毛尿囊膜，用 pH7.2，0.01 mol/L PBS 冲洗后，用研磨器磨碎后连续冻融 3 次 4 次，1，000 r/min 离心 10 min 后取上清液，按终浓度 0.1%的量加入甲醛溶液。4SN/T 146720205.3.4.2 打孔在制备的琼脂板上，按照图 2 打孔，孔径约 5 mm，孔距 2 mm 5 mm。将孔中的琼脂用针头轻轻挑出或吸出，勿伤边缘，以免渗漏。图 2 5.3.4.3 封底用酒精灯轻烤平皿或玻璃板底部，封闭孔的底部，以防侧漏。5.3.4.4 加样用微量移液器吸取标准阳性血清加到 S 孔中，标准抗原滴入+孔中，按照 5.3.4.1 制备好的抗原悬液加入其他外周孔，每孔均以加满不溢为度。每加一个样品换一个吸头。5.3.4.5 作用加样完毕后，静置 5 min 10 min，然后将平皿水平倒置或玻璃板水平正置放入湿盒内，于 37 温箱中作用，分别作用 24 h、48 h 及 72 h 后观察并记录结果。5.3.4.6 结果判定5.3.4.6.1 在暗背景下，将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，若标准抗原悬液孔与中心标准阳性血清孔之间出现一条清晰致密的白色沉淀线，则试验成立，否则视为无效，需重做。5.3.4.6.2 若被检抗原液与中心标准阳性血清孔之间出现沉淀线，并与标准抗原悬液的沉淀线末端相吻合，即可判定被检抗原悬液为阳性（如图 2 所示 1 号孔）。5.3.4.6.3 若被检抗原与中心标准阳性血清孔之间不出现沉淀线，但标准抗原悬液的沉淀线一端弯向抗原悬液孔（如图 2 所示 3 号孔），则被检抗原悬液判为弱阳性（凡弱阳性者应重复试验，仍未弱阳性者，判为阳性）。5.3.4.6.4 若被检抗原悬液与中心标准阳性血清孔之间不出现沉淀线且标准抗原悬液沉淀线直向被检抗原悬液孔或向其外侧偏弯者（如图 2 所示 2 号孔），则被检抗原悬液判为阴性。5.3.4.6.5 若被检抗原悬液与中心标准阳性血清之间的沉淀线与标准抗原悬液和中心标准阳性血清孔之间的沉淀线交叉直伸（如图 2 所示 4 号孔），则判为非特异性反应，应重复该试验。若仍出现非特异性反应则判为阴性。5.4 聚合酶链反应（PCR）5.4.1 试剂5.4.1.1 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。5SN/T 146720205.4.1.2 实验用水（应符合 GB/T 6682 中一级水的规格），Taq 酶，PCR 缓冲液（与 Taq 酶匹配），氯化镁（MgCl2，25 mmol/L），dNTPs(dATP，dCTP，dGTP，dTTP，各 2.5 mmol/L)，酚/三氯甲烷/异戊醇（体积比 25241），三氯甲烷，异丙醇（-20 预冷），琼脂糖，DNA 相对分子量标准物 Marker DL 2 000。5.4.1.3 生理盐水、DNA 提取液、75%乙醇、TE 溶液(pH8.0)、电泳缓冲液（1TBE 或 1TAE）、溴化乙锭溶液（10 mg/mL）、上样缓冲液，配制方法见附录 C。5.4.1.4 小鹅瘟标准毒株或其 DNA（由指定单位提供）。5.4.1.5 引物。上游引物：5-CAACGCAGGATCAGACGAAGAC-3；下游引物：5-AGCGAACATGCTATGGAAAGGA-3。5.4.2 设备PCR 扩增仪，生物安全柜，凝胶成像系统，消毒灭菌锅，制冰机，核酸蛋白分析仪，高速冷冻离心机，台式小型离心机，低温冰箱，超纯水器，旋涡震荡器。5.4.3 样品前处理组织等固体状样本加入少量生理盐水后，充分匀浆，制成 10%20%的悬浮液备用；液体样本充分混匀后直接取用。5.4.4 模板 DNA 制备5.4.4.1 样本模板 DNA 的制备取以上制备的样本悬浮液 200 L，加入 750 L DNA 提取液，65 温浴 30 min，加苯酚/三氯甲烷/异戊醇 500 L，振荡混匀，13 000 r/min 离心 5 min，吸取上清液加入等体积的三氯甲烷，振荡混匀，13 000 r/min 离心 5 min，吸取 500 L 上清液与 400 L 的异丙醇充分混合，13 000 r/min 离心5 min，75%乙醇冲洗沉淀一次，13 000 r/min 离心 5 min，弃去上清，沉淀干燥后溶于 30 L TE 溶液中，立即用于检测或短期保存于-20。也可使用其它经验证的 DNA 提取方法或等效的商品化病毒 DNA 提取试剂盒，按照其使用说明操作。5.4.4.2 对照设立检测过程中分别设阳性对照、阴性对照与空白对照。阳性对照为小鹅瘟标准毒株 DNA 或含目标核酸序列的人工合成的 DNA，阴性对照为鹅组织，空白对照为无菌水。6SN/T 146720205.4.5 反应体系10PCR 缓冲液 2.5 L、dNTPs（10 mmol/L）2 L、氯化镁（25 mmol/L）2 L、引物（20 mol/L）各 0.5 L、Taq DNA 聚合酶（5 U/L）0.25 L、模板 DNA 5 L 10 L（约 50 ng 100 ng），用灭菌的超纯水补足反应体积至 25 L。也可使用等效商品化 PCR 反应预混液。5.4.6 反应条件95 预变性 7 min；94 变性 30 s，51 退火 30 s，72 延伸 40 s，进行 35 个循环；72 延伸 10 min；4 保存反应产物。反应体系与条件可以根据仪器型号或反应预混液类型进行等效评估，并作适当的参数调整。5.4.7 PCR 产物电泳称取 1.5 g 琼脂糖，加入 100 mL 电泳缓冲液加热溶解，加入溴化乙锭溶液至终浓度为 1 g/mL，制胶，PCR 扩增产物与适量加样缓冲液