SNT 1961.7-2013 出口食品过敏原成分检测 第7部分：实时荧光PCR方法检测胡萝卜成分.pdf

SN/T1961.7-2013剂均用无DNA酶污染的容器分装。5.1胡萝卜成分扩增引物和探针、内参照（真核生物成分）引物和探针详见表1。表1试验用引物和探针名称序列(5-3)目的基因TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA内参照5端引物AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT内参照3端引物真核生物18 SrRNA基因FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC内参照探针TAMRA胡萝卜5端引物CGACAAGCAAGCTTTACTCCAA胡萝卜3端引物CGTCTGACACCCATGAGTCTGT胡萝卜抗冻蛋白基因胡萝卜探针FAM-TCAAAACAGCCTTGAAAAACCCCACCA-TAMRA5.2CTAB提取缓冲液：CTAB20g/L,氯化钠1.4mol/L,Tris0.1mol/L,Na:EDTA20mmol/L,pH8.0,高压灭菌。使用前加入终浓度为2%的B巯基乙醇。，5.3CTAB沉淀液：CTAB5g/L,氯化钠0.04mol/L,pH8.0,高压灭菌。5.4TE缓冲液(Tis-Cl、EDTA缓冲液)：l0mmol/LTis-HCI(pH8.0),1mmol/L EDTA(pH8.0)。5.510PCR缓冲液：200mmol/L Tris-HC1(pH8.4),100mmol/LKCl,20mmol/L MgSO,160 mmol/L(NH,)2 SO,1%Triton X-100,1 mg/mL BSA.5.6氯化钠溶液：1.2mol/L。5.7RNA酶溶液：54g/L.5.8蛋白酶K:20mg/uL。5.9Tris饱和酚。5.10三氯甲烷。5.11异戊醇。5.12异丙醇。5.1370%乙醇。5.14 Tag DNA聚合酶。5.15dNTP混合液。6仪器和设备6.1实时荧光PCR仪。6.2离心机：最大离心力16000g。6.3微量移液器：10L、100L、200L、1000L。6.4冰箱：2一8，一20。6.5高压灭菌器。6.6核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.7pH计。6.8天平：感量0.01g。SN/T1961.7-20137检测步骤7.1制样方法称取待测样品10g,用洁净研钵或合适的粉碎装置将样品充分研磨混匀。7.2DNA提取7.2.1称取经过预处理的待测样本1g,转人15mL离心管中，半固体样品和液体样品取2mL4mL。加人5mL65预热的CTAB提取缓冲液和RNA酶（使其终浓度为10g/mL),颠倒混匀后65温育30min,期间颠倒混匀离心管2次3次；7.2.212000g离心10min,取1mL上清液至2mL离心管中；加人与上清液等体积的三氯甲烷，颠倒混匀后，12000g离心10min,转移上清液至新的2mL离心管中；7.2.3加人2倍体积的CTAB沉淀液，颠倒混匀，室温静置1h;7.2.412000g离心10mi,弃去上清液，加入400L氯化钠溶液溶解沉淀，加等体积三氯甲烷，颠倒混匀；7.2.512000g离心10min,取上层水相到1.5 mL Eppendorf离心管中，加人0.6倍体积4预冷的异丙醇溶液，颠倒混匀，4静置30min;7.2.612000g离心10min,弃去上清液，加入4预冷的70%乙醇500L,涡旋清洗沉淀；7.2.712000g离心5min,弃去上清液，室温条件下过夜或者60烘15min25min,注意不要让沉淀过干。加100LTE缓冲液溶解沉淀，一20保存。7.3DNA浓度和纯度的测定取适量DNA溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的吸收值。DNA的浓度按照式(1)计算。C=A260 X NX50(1）式中：c一DNA浓度，单位为微克每毫升(ug/mL);Az60260nm处的吸光值；N核酸稀释倍数。当浓度为104g/mL1004g/mL,Az6o/A28比值在1.71.9之间时，适宜于实时荧光PCR扩增。7.4实时荧光PCR定性检测7.4.1实时荧光PCR反应体系反应体系总体积为25L,其中含：样品DNA(104g/mL100ug/mL)2L,胡萝卜引物(10mol/L)各1L,胡萝卜探针(104mol/L)1L,Taq DNA聚合酶(5U/L)0.3L,dNTP(各2.5mmol/L)2L,10XPCR缓冲液2.5L,水15.2L。也可采用商品化的实时荧光PCR扩增体系：实时荧光PCR预混液2L,样品DNA2L,胡萝卜引物对各1L,胡萝卜探针1L,水补足至总体积25L。真核生物内参照的反应体系同上，仅以真核生物引物对和探针替换胡萝卜引物对和探针。7.4.2实时荧光PCR反应参数952min,预变性；9515s,6040s,45个循环扩增。3