SNT 1943-2007 小麦中转基因成分PCR和实时荧光PCR定性检测方法.pdf

SN/T1943-20073.2.5NOS:terminator of nopaline snthase gene from Agrobacterium tume faciens,来源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子。3.2.6NTC:no template control,空白对照。3.2.7 Ubiquintin:玉米泛素蛋白基因启动子3.2.8uidA:betaglucuronidase(GUS)reporter gene from E.coli,大肠杆菌转？葡糖苷酶基因。3.2.9Wx0l2:wheat waxiness gene,小麦蜡质基因，是小麦物种特异性内源基因。4防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照SN/T1193中的规定执行。5抽样和制样5.1抽样按照SN/T1194中规定的方法执行。5.2制样称取约20g小麦样品，在粉碎机中研磨至样品成粉末。6方法提要样品经过提取DNA后，针对转基因小麦内外源基因所设计的引物和探针序列，分别通过PCR和实时荧光PCR技术，特异性扩增内外源基因的DNA片段，并根据PCR和实时荧光PCR检测结果，判断该样品中是否含有转基因成分。7试剂除另有规定外，其他试剂为分析纯或生化试剂，水为按照GB/T6682规定的一级水。7.1CTAB裂解液：3%CTAB(质量分数)，1.4mmol/L氯化钠，0.2%（体积分数）巯基乙醇，20 mmol/L,EDTA,100 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0.7.2TE缓冲液(pH8.0):量取10mL1mol/L Tris-CI(pH8.0)和2mL0.5mol/L EDTA(pH8.0),加水定容至1000mL,分装后高压灭菌备用。7.310PCR缓冲液：100mmol/L氯化钾(KCl),160mmol/L硫酸铵(NH,),SO,20mmol/L硫酸镁(MgSO,),200mmol/L.Tris-HCl(pH8.8),1%Triton X-100,1mg/mL BSA。7.4氯化镁。7.5dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP.7.6 Tag DNA聚合酶。7.7三氯甲烷。7.8异戊醇。7.9异丙醇。7.1070%乙醇。7.11 RNaseA:2 mg/uL.7.12引物和探针：根据附录A中表A.1,表A.2的序列合成引物和探针，加超纯水配制成100mol/L储存，用于PCR测试的引物浓度为10mol/L。7.13溴化乙锭：10mg/mL7.14DNA:分子量标记100bp2000bp。7.15琼脂糖。7.1650TAE缓冲液：称取484 g Tris,量取114.2mL冰乙酸，200mL0.5mol/L EDTA(pH8.0),2