SNT 1905-2007 牛病毒性腹泻粘膜病反转录聚合酶链反应操作规程.pdf

SN/T1905-2007DNA Marker DL20004.2.750Tris-冰乙酸(TAE)电泳缓冲液：配制方法见第A.5章。4.2.810mg/mI,溴化乙锭溶液：配制方法见第A.6章。4.2.91%琼脂糖凝胶：配制方法见第A.7章。4.2.10引物：根据病毒性腹泻/粘膜病病毒(BVDV)国际标准株基因序列，在其最保守的5端非编码区序列设计合成一对特异性引物：5-AGGCTAGCCATGCCCTTAGT-3,5-TCTGCA(GCACCCTATCAGG-3配制成20mol/L,一20保存。4.2.11可调微量移液器(20L1000L、20L200L、2L20L、0.5L10L)。4.2.121.5ml、0.2mL离心管和吸头（用DEP水处理后高压灭菌备用，处理方法见第A.8章）4.3标准毒株和细胞4.3.1标准毒株：以BVDV国际标准毒株NADI株或Oregon C24V株为试验的参照病毒株。4.3.2细胞：按常规方法取健康新生犊牛睾丸，制备原代睾丸细胞。5阳性对照样品和阴性对照样品5.1阳性对照样品由指定单位提供或按下列方法制备：将牛病毒性腹泻-粘膜病国际标准毒株按10%接种原代睾丸细胞，于37吸附1h后加入维持液，37培养，待CPE达到70%时收获病毒悬液：冻融2次3次，5000r/min离心10min,取上清液备用。5.2阴性对照样品由指定单位提供或按下列方法制备：将生长良好的原代睾丸细胞，冻融2次3次，5000r/min离心l0min,取上清液备用。6试验方法6.1样品的处理6.1.1组织样品：包括从肠粘膜刮取的物质、肾、肝、肺、淋巴结、脾、胸腺。取2g5g组织样品切成小块，加5mLl5mL预冷的Hanks平衡盐溶液匀浆2min,制成悬液，45000r/min离心10min,取150I,上清液加入1mI.Ca1-14振荡混匀。6.1.2液体样品：包括血清、血液（加柠檬酸盐、EDTA、肝索等）、各种拭子（鼻腔、气管和眼）、精液。6.1.2.1含EDTA的血液：取50uL加到装有1mL1SSC(见第A.9章)溶液的离心管中，混匀，412000r/min,离心1min,倒掉上清液，将沉淀物重新悬浮于残留液中，加人500 uL Cat-14振荡混匀。6.1.2.2含柠檬酸钠或肝素的血液：取50uL加入500LCat-14振荡混匀。6.1.2.3血清、精液、各种拭子悬液等液体样品：取100L,加入500LCat-14振荡混匀。6.1.3阴性和阳性对照样品：分别取100L,加入500LCa1-14振荡混匀。6.2RNA的提取上述各种处理样品立即振荡30s,室温放置10min30min,样品412000r/min,离心5min,倒置于吸水纸上，沾干液体，瞬时离心5s,用带滤芯的吸头吸干残留液体，将沉淀溶于200 L GITC(见第A.10章)缓冲液里，间歇振荡5min,置于冰上。上述悬浮液用100L水饱和酚和100L预冷的含2%正丁醇的三氯甲烷进行抽提，振荡30s,412000r/min,离心5min;取上清液；加入100L预冷（一20）的含2%正丁醇的三氯甲烷振荡30s,412000r/min,离心5min,取上清液。上清液加入300I,异丙醇，一70冻存0.5h,或者一20至少1h(过夜或更长时间)。取出后412000r/min,离心5min,用5004L80%乙醇漂洗，再用500L100%预冷（一20）2