SNT 2497.19-2010 进出口危险化学品安全试验方法 第19部分：Northern Blot实验.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 进出口危险化学品安全试验方法第 部分：犖 狅 狉 狋 犺 犲 狉 狀犅 犾 狅 狋实验犜 犲 狊 狋犿 犲 狋 犺 狅 犱狅 犳 犻 犿 狆 狅 狉 狋 犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋犱 犪 狀 犵 犲 狉 狅 狌 狊 犮 犺 犲 犿 犻 犮 犪 犾 狊犘 犪 狉 狋 ：犜 犲 狊 狋 狅 犳犖 狅 狉 狋 犺 犲 狉 狀犅 犾 狅 狋 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言 进出口危险化学品安全试验方法 系列标准共分为 部分：第部分：体内哺乳动物肝细胞程序外 合成（）试验；第部分：空斑形成细胞（）试验；第部分：大型溞繁殖试验；第部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验；第部分：睾丸细胞 试验；第部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验；第部分：小鼠耳肿胀试验；第部分：腘窝淋巴结试验；第部分：血清溶血素测定试验；第 部分：淋巴细胞增殖功能测定试验；第 部分：种系突变试验；第 部分：单细胞凝胶电泳分析试验；第 部分：荧光原位杂交试验；第 部分：聚丙烯酰胺凝胶电泳试验；第 部分：实验；第 部分：实验；第 部分：哺乳动物行为毒理学试验；第 部分：加合物的检测方法；第 部分：实验；第 部分：法测定蛋白质含量；第 部分：琼脂糖凝胶电泳试验；第 部分：的 值测定方法；第 部分：细胞器的分离实验方法；第 部分：细胞免疫功能体外检测方法；第 部分：体液免疫功能试验；第 部分：巨噬细胞功能试验；第 部分：流式细胞术检测凋亡；第 部分：穿梭质粒在突变检验中的应用；第 部分：生化需氧量（）测定。本部分为 系列标准的第 部分。本部分修改采用 分子克隆实验指南 第二版，其有关技术内容与上述方法完全一致，在标准文本格式上按 做了编辑性修改。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。本部分主要起草人：于艳军、王利兵、李晶、李学洋、赵好力宝、吕刚。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛 犖犜 进出口危险化学品安全试验方法第 部分：犖 狅 狉 狋 犺 犲 狉 狀犅 犾 狅 狋实验范围 的本部分规定了进出口危险化学品 实验的主要试剂和材料、主要仪器设备、试验步骤和结果分析。本部分适用于检测进出口危险化学品引起的基因转录异常。术语、定义和缩略语 术语和定义下列术语和定义适用于本部分。核酸探针狀 狌 犮 犾 犲 犻 犮犪 犮 犻 犱狆 狉 狅 犫 犲能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记的核苷酸链。缩略语下列缩略语适用于本部分。犕犗 犘 犛（犖 玛琳代）丙磺酸 犚 犖 犃核糖核酸原理在变性条件下将待检的 样品通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其他标记物标记的 或 探针进行杂交和放射自显影。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，从而显示出待检 的片段及其相对大小。试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水为灭菌蒸馏水或超纯水。甲醛凝胶电泳缓冲液：（值），乙酸钠，（值）。甲醛凝胶加样缓冲液：甘油，（值），溴酚蓝，二甲苯青。溴化乙锭溶液：，用 乙酸铵配制。溶液：在 水中溶解 和 柠檬酸钠，加入数滴 溶液调节 值至，加水定容至，分装后高压灭菌。，由 溶液稀释而成。杂交液：甲酰胺，试剂，。仪器设备 电泳仪。犛 犖犜 凝胶成像系统。试验步骤 甲醛琼脂糖凝胶电泳 制备凝胶：将适量琼脂糖溶于水，冷却至 ，加入甲醛凝胶电泳缓冲液和甲醛至终液浓度分别为和 （将 甲醛贮存液、琼脂糖水溶液和甲醛凝胶电泳缓冲液按 比例混合）。在化学通风橱内灌制凝胶，于室温放置 或更长时间，是凝胶凝固。样品制备：将以下几种溶液：（）甲醛凝胶电泳缓冲液 甲醛 甲酰胺 于 温浴 ，冰浴冷却，离心使管内所有液体集中于管底，加灭菌的并经用 处理的甲醛凝胶加样缓冲液。加样前，将凝胶预电泳 ，电压降为，随后将样品加至凝胶加样孔。将凝胶浸入甲醛凝胶电泳缓冲液中，（）电压降进行电泳。电泳结束后（溴酚蓝迁移出去约），切下相对分子质量标准参照物的凝胶条，浸入溴化乙锭溶液中染色（）。在紫外灯下照像，测量照片上每个 条带至加样孔的距离，以 片段大小的对数值对 条带的迁移距离作图，用所得曲线计数从凝胶转移到固相支持体通过杂交所检出的 分子的大小。毛细管洗脱法将 自琼脂糖凝胶转至硝酸纤维素滤膜。将凝胶移至一个玻璃干烤皿内，用刀片修去凝胶的无用部分，做好标记。用长和宽约大于凝胶的一块有机玻璃或一叠玻璃板作为平台，将其放入大干烤皿内，上面放一张滤纸，倒入 使页面略低于平台表面，当平台上方的 滤纸湿透后，用玻棒赶出所有的气泡。裁一张长度和宽度分别比凝胶大 的硝酸纤维素滤膜，浮在去离子水表面，直至滤膜从下向上湿透为止，随后用 浸泡滤膜至少 ，做好标记。将凝胶翻转后置于平台上湿润的滤纸中央，滤纸和凝胶之间不能滞留气泡。在凝胶上方放置湿润的硝酸纤维素滤膜。滤膜置于凝胶表面适当位置后，就不应轻易移动，滤膜与凝胶之间不应留有气泡。用 溶液浸湿两张与凝胶同样大小的滤纸，湿润的滤纸放置在湿润的硝酸纤维素滤膜上方，用玻璃棒赶出其间滞留的气泡。用保鲜膜在四周封边，切一叠（）高 略小于滤纸的纸巾，将其放置在滤纸的上方，并在纸巾上方放一块玻璃板，然后用一 的重物压实。使上述 转移持续进行（），每当纸巾浸湿后，应换新的纸巾。转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和滤纸，翻转凝胶和硝酸纤维素滤膜，以凝胶的一面在上，置于一张干的滤纸上，标记凝胶加样孔的位置。从硝酸纤维素滤膜上剥离凝胶弃之。以 溶液于室温浸泡滤膜 。从 溶液中取出滤膜，将滤膜上的溶液滴尽后平放在一张纸巾上。于室温晾干 以上。将晾干的滤膜放在两张 滤纸中间，用真空炉于 干烤（）。仅适用于滤膜上含有乙醛酰 的情况：杂交前需要 （）于 犛 犖犜 洗膜，除去 上的乙二醛分子。杂交和放射自显影 加入杂交液，预杂交（）。加入变性的放射性标记探针，在适宜温度下继续孵育（）。用 、于室温洗膜 ，随后用 、于 洗膜次，每次 。用 光片进行放射自显影，于 曝光（）。试验结果用凝胶成像系统对 光片进行拍照、作图，并用图像分析软件进行结果分析。犛 犖犜 书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准进出口危险化学品安全试验方法第 部分：犖 狅 狉 狋 犺 犲 狉 狀犅 犾 狅 狋实验 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京复兴门外三里河北街 号邮政编码：网址 电话：中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号：定价 元