SNT 2497.1-2010 进出口危险化学品安全试验方法 第1部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成(UDS)试验.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 进出口危险化学品安全试验方法第部分：体内哺乳动物肝细胞程序外犇 犖 犃合成（犝 犇 犛）试验犜 犲 狊 狋犿 犲 狋 犺 狅 犱狅 犳 犻 犿 狆 狅 狉 狋 犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋犱 犪 狀 犵 犲 狉 狅 狌 狊 犮 犺 犲 犿 犻 犮 犪 犾 狊犘 犪 狉 狋：犝 狀 狊 犮 犺 犲 犱 狌 犾 犲 犱犇 犖 犃狊 狔 狀 狋 犺 犲 狊 犻 狊（犝 犇 犛）狋 犲 狊 狋狑 犻 狋 犺犿 犪 犿犿 犪 犾 犻 犪 狀犾 犻 狏 犲 狉犮 犲 犾 犾 狊犻 狀 狏 犻 狏 狅 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言 进出口危险化学品安全试验方法 系列标准共分为 部分：第部分：体内哺乳动物肝细胞程序外 合成（）试验；第部分：空斑形成细胞（）试验；第部分：大型溞繁殖试验；第部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验；第部分：睾丸细胞 试验；第部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验；第部分：小鼠耳肿胀试验；第部分：腘窝淋巴结试验；第部分：血清溶血素测定试验；第 部分：淋巴细胞增殖功能测定试验；第 部分：种系突变试验；第 部分：单细胞凝胶电泳分析试验；第 部分：荧光原位杂交试验；第 部分：聚丙烯酰胺凝胶电泳试验：第 部分：实验；第 部分：实验；第 部分：哺乳动物行为毒理学试验；第 部分：加合物的检测方法；第 部分：实验；第 部分：法测定蛋白质含量；第 部分：琼脂糖凝胶电泳试验；第 部分：的 值测定方法；第 部分：细胞器的分离实验方法；第 部分：细胞免疫功能体外检测方法；第 部分：体液免疫功能试验；第 部分：巨噬细胞功能试验；第 部分：流式细胞术检测凋亡；第 部分：穿梭质粒在突变检验中的应用；第 部分：生化需氧量（）测定。本部分为 的第部分。本部分修改采用经济合作与发展组织（）化学品测试指南 （）体内哺乳动物肝细胞程序外 合成（）试 验，其 有 关 技 术 内 容 与 上 述 方 法 完 全 一 致，在 标 准 文 本 格 式 上按 做了编辑性修改。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。本部分主要起草人：贾晓川、王利兵、李宁涛、张园、赵青、熊中强。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛 犖犜 进出口危险化学品安全试验方法第部分：体内哺乳动物肝细胞程序外犇 犖 犃合成（犝 犇 犛）试验范围 的本部分规定了进出口危险化学品体内哺乳动物肝细胞程序外 合成（）试验的术语和定义、试验原理、试验程序和试验结果。本部分适用于进出口危险化学品体内哺乳动物肝细胞程序外 合成（）试验检测。规范性引用文件下列文件中的条款通过 的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。体内哺乳动物肝细胞程序外 合成（）试验术语和定义 确立的以及下列术语和定义适用于本部分。净核银粒狀 犲 狋狀 狌 犮 犾 犲 犪 狉犵 狉 犪 犻 狀 狊，犖 犖 犌在放射自显影 试验中细胞内 活性的定量测定，计算为核银粒数（）减去等于核面积的细胞质内银粒平均数（），即：。由各细胞计算 数，再将一个培养物或平行培养物中的细胞 汇总。正修复的细胞 犮 犲 犾 犾 狊 犻 狀狉 犲 狆 犪 犻 狉净核银粒（）高于本试验室历史性阴性对照值的细胞。程序外犇 犖 犃合成狌 狀 狊 犮 犺 犲 犱 狌 犾 犲 犱犇 犖 犃狊 狔 狀 狋 犺 犲 狊 犻 狊，犝 犇 犛在切除含有由化学物质或物理因素引起损害的一段 后，进行的 修复合成。试验原理体内哺乳动物肝细胞程序外 合成（）试验的目的是为了鉴定能诱发染毒动物肝细胞 修复的物质。体内试验提供了一种研究化学物质肝脏遗传毒性效应的方法，测试的终点表明肝细胞发生 损伤及随后发生的修复。肝脏是机体吸收的化学物质代谢的主要器官，因此肝脏是检测体内 损伤的适宜部位。化学或物理因素诱发 损伤后，细胞启动程序外 合成程序以切除或移除 损伤的区域，体内哺乳动物肝细胞 试验就是检测受损 的修复合成过程。肝细胞周期中处于期频率犛 犖犜 很低，因此本试验通常用放射自显影检测 （胸腺嘧啶脱氧核苷）掺入肝细胞 。与液闪计数法比较，放射自显影法对期细胞的干扰不敏感。试验方法 试验动物 动物选择应该利用常用品系的健康刚成年动物。首选大鼠，也可选用其他适当的哺乳动物。在试验开始时，动物体重差异应不超过每种性别平均体重的。饲养条件动物室的温度应为，相对湿度一般维持在 ，除非在清洁动物房，相对湿度最好控制在 。光照采用人工照明，明暗交替控制。饲以常规实验室饲料，不限饮水。如果受试物掺入饲料进行染毒，应选择适当的饲料以保证与受试物充分混合。动物可单独饲养或同性别分小组笼养。动物的准备健康刚成年的动物随机分配到对照组和染毒组，饲养笼也应随机分配，以使饲养笼放置的可能影响效应减小。动物应适应试验条件至少。受试物准备 受试物处理固体受试物应溶于或悬浮于适当的溶剂赋形剂，并于动物染毒前稀释。液体受试物可直接染毒，或在染毒前稀释。应新鲜制备受试物，除非稳定性资料证明可以贮存。溶剂赋形剂溶剂赋形剂在所用剂量水平不应产生毒效应，不应与受试物反应。如利用未充分了解的溶剂赋形剂，应有其相容性的资料，推荐首先考虑使用水性溶剂赋形剂。剂量与分组 剂量水平 通常设个剂量组。最高剂量应产生毒性，如根据相同的染毒方案更高剂量可产生动物死亡。较低剂量一般应为高剂量的 。在较低的无毒性剂量就有特殊生物活性的物质（如激素和有丝分裂原）可能是剂量设置标准的例外，并应逐例评价。如无适当的资料，需进行确定剂量范围试验，应在同一实验室利用同一品、系、性别的动物和染毒方案。最高剂量也可规定为引起肝脏某些毒性（如核固缩）的剂量。对照 每个试验都应包括同时进行的阳性对照和阴性（溶剂赋形剂）对照。除了受试物染毒不同之外，对照组动物应以与染毒组动物相同的方式进行操作。阳性对照在暴露水平应预期得到超过本底值的 增加。阳性对照剂量应使效应很清楚，但并不使读片者立即发现其为阳性对照标本片。阳性对照的染毒途径可以不同于受试物染毒途径。阳性对照物包括：早期采样（），二甲基亚硝胺（，号 ）；晚期采样（），乙酰氨基芴（，号 ）。动物的数量和性别 应利用适当的动物数。每组至少有只可供分析的动物。如已有充分的本底对照数据库，则同时进行的阴性和阳性对照组仅需或只动物。犛 犖犜 w w w.b z f x w.c o m 如在进行本试验时，已有资料表明同一品系、相同的暴露途径，在不同性别之间毒性无差别，则用单一性别（优先用雄性）动物即可。当人暴露于受试物可能有性别特异性（如某些药物），则应在适当的性别进行试验。试验步骤 染毒程序受试物通常采用一次染毒。限度试验如果单次染毒剂量水平或同一天次染毒的剂量水平（按体重计）达到至少 ，未观察到毒性效应，并且根据结构相关化合物的资料表明受试物无遗传毒性，则不需要进行个剂量水平的完整试验。除非人类暴露的受试物的资料表明需要在限度试验中使用更高的剂量水平。染毒受试物通常用灌胃或合适的进行插管套管经口染毒。只要证明合理也可采用其他的染毒途径。一次灌胃或注射染毒的最大液体容积应不超过 。若利用更高容积，必须说明理由。除了刺激性或腐蚀性物质（通常刺激性作用会随浓度的升高而加重）外，应当通过调整浓度使受试物的体积差别降到最低，使所有剂量水平的受试物体积保持相同。肝细胞制备 动物染毒后 制备肝细胞。除非在 具有明显的阳性反应，一般应增加早期采样时间（一般在染毒后）。也可根据已有的毒物代谢动力学资料，利用其他采样时间。通常采用胶元酶原位灌注肝，分离肝细胞，贴壁后，进行哺乳动物肝细胞短期培养。阴性对照动物的肝细胞存活率应至少在 以上。犝 犇 犛标本制备新分离的哺乳动物肝细胞通常在含 的培养液中培养。在培养期末，移去培养基后，细胞再培养在含过量未标记胸腺嘧啶的培养液之中，以除去未掺入的放射性。如培养时间较长可免去此操作。然后，细胞再经淋洗、固定和干燥。标本片浸涂放射自显影乳胶，置于黑暗中（如冰箱）曝光、显影、染色，计数银粒。每个动物制备个个标本片。分析 标本片应有足够的形态正常的细胞，以进行 评价。应在显微镜下检查细胞毒性（如核固缩、放射标记水平降低）。标本片应在读片前编号。每个动物至少从个标本片计数 个细胞，如每个动物计数少于 个细胞，应说明理由。对期细胞核不计数银粒，但应记录期细胞的比例。以适当的方法计数在形态正常细胞的核和胞质中 掺入量，以作为银粒沉淀的依据。测定核内银粒数（）和与核面积相当的胞质内银粒数（）。数可以取细胞内标记最多的区域，或从接近核的胞质随机数（）个区域的均值。如果合理，可以利用其他的计数方法（如全细胞计数）。试验结果 结果处理应提供每张标本片和每只动物的数据。所有的资料应总结成表格形式。由各个细胞、各动物、各剂量和采样时间的 减去 计算净核银粒。如果计数“正修复的细胞”，应核实“正修复的细胞”的标准，并根据历史数据或同时进行的阴性对照数据。计数的结果可以用统计学方法评价。如使用统计学方法，应于试验前合理选择。犛 犖犜 w w w.b z f x w.c o m 结果评价和解释 评价阳性和阴性反应的标准：）阳性反应：净核银粒（）高于根据试验室本底对照资料预先设定的阈值；或 值高于同时进行的阴性对照，并有统计学显著性。）阴性反应：在本底对照值的范围内或低于此阈值；或 并不显著高于同时进行的阴性对照。应考虑数据的生物学关联，及多种参数，如动物间变异、剂量反应关系和细胞毒性等。可利用统计学方法，以有助于评价试验结果。但是统计学意义不应作为判定阳性反应的惟一因素。虽然大多数试验将得到明确的阳性或阴性结果，但在少见的情况下，所得到的资料不能对受试物的活性进行明确的判断，经多次重复试验，结果仍然是意义不明或可疑。哺乳动物肝细胞体内 试验阳性结果表明受试物对哺乳动物肝细胞引起 损伤，此损伤能在体外经程序外 合成修复。阴性结果表明在试验条件下受试物不诱导在本试验可检测的 损伤。应该讨论受试物或其代谢产物到达体循环或靶器官（如系统毒性）的可能性。试验报告试验报告应包括下列资料：）受试物 物理性质和纯度；与进行本试验有关的物理化学性质。）溶剂赋形剂 溶剂赋形剂选择依据；受试物在溶剂赋形剂中的溶解性和稳定性（如已知）。）试验动物 所用动物的品系；动物的数量、畜龄和性别；来源、饲养条件、饲料等；在试验开始时动物的个体体重，包括每组的体重范围、均数和标准差。）试验条件 阳性对照和阴性（溶剂赋形剂）对照；染毒途径；证明受试物到达体循环或靶器官的方法（如进行）；染毒和采样方案；测定毒性的方法；睾丸胞制备和培养方法；制备的标本片数和计数的细胞数。）结果 各个标本片、各个动物和各组的、和 的均值；剂量 反应关系；毒性表现；同时进行的阴性（溶剂赋形剂）对照和阳性对照资料；本底阴性（溶剂赋形剂）对照和阳性对照资料包括范围、均数和标准差；犛 犖犜 “正修复的细胞”数（如测定）；期细胞数（如测定）；细胞存活率。）结果的讨论。）结论。犛 犖犜 书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准进出口危险化学品安全试验方法第部分：体内哺乳动物肝细胞程序外犇 犖 犃合成（犝 犇 犛）试验 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京复兴门外三里河北街 号邮政编码：网址 电话：中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号：定价 元