SNT 2416-2010 进出口食品中金黄色葡萄球菌肠毒素A检测方法 电泳和免疫印迹法.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 进出口食品中金黄色葡萄球菌肠毒素犃检测方法电泳和免疫印迹法犇 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀犿 犲 狋 犺 狅 犱狅 犳 狊 狋 犪 狆 犺 狔 犾 狅 犮 狅 犮 犮 犪 犾 犲 狀 狋 犲 狉 狅 狋 狅 狓 犻 狀犃犻 狀犳 狅 狅 犱犈 犾 犲 犮 狋 狉 狅 狆 犺 狅 狉 犲 狋 犻 犮犪 狀 犱 犻 犿犿 狌 狀 狅 犫 犾 狅 狋犿 犲 狋 犺 狅 犱 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准参考了美国 第 章 食品中金黄色葡萄球菌肠毒素 电泳和免疫印迹方法（：）。本标准的附录 为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：冯家望、李丹琳、王小玉、唐食明、郑晶、伍朝辉、游淑珠、陈彬。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛 犖犜 进出口食品中金黄色葡萄球菌肠毒素犃检测方法电泳和免疫印迹法范围本标准规定了进出口食品中金黄色葡萄球菌肠毒素 的电泳和免疫印迹检测方法。本标准适用于进出口食品中金黄色葡萄球菌肠毒素 的检测。规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。食品卫生微生物学检验金黄色葡萄球菌检验 实验室生物安全通用要求术语和定义下列术语和定义适用于本标准。金黄色葡萄球菌肠毒素犃 狊 狋 犪 狆 犺 狔 犾 狅 犮 狅 犮 犮 犪 犾 犲 狀 狋 犲 狉 狅 狋 狅 狓 犻 狀犃；犛 犈 犃由金黄色葡萄球菌产生的蛋白质外毒素，是其中一种主要血清型。免疫印迹法 犻 犿犿 狌 狀 狅 犫 犾 狅 狋将蛋白质转移到固相载体上，利用抗体与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应进行检测。原理 （十二烷基磺酸钠）与蛋白质分子结合形成带负电荷的蛋白质 复合物。在电场的作用下，蛋白质 复合物向带有异相电荷的电极移动。根据聚丙烯酰胺凝胶分子筛效应，复合物迁移的速度与其分子量成负相关。将电泳分离的组分转移并固定在化学合成膜等固相载体后，以特定的免疫反应以及显色系统分析印迹。实验室生物安全要求 实验室应按照 对生物安全级（）实验室的生物安全要求执行。当进行可能产生气溶胶或液体溅出的操作时，或者可能产生大量毒素的实验时，除 外，应同时按照 对 安全设备和个体防护的要求执行。使用过的实验用品应按照 对废弃物进行无害化处理。设备和材料 垂直凝胶系统。犛 犖犜 转移系统。电泳仪：恒压不低于 ，恒流不低于 。推荐使用带有计时器的电源。离心机：适用 离心管，转速不低于 。均质器。硝酸纤维膜。涡旋振荡器。扫描仪：推荐辨析率不低于 。离心管：。试剂 标准物质（）。）标准物质 是适合的市售产品的实例，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。）抗 血清 是适合的市售产品的实例，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。）抗血清碱性磷酸酶 是适合的市售产品的实例，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。抗 血清（）。抗血清碱性磷酸酶（）。：。对甲苯胺蓝氯化硝基四氮唑蓝。四甲基二乙胺。甲醇：分析纯。异丁醇：分析纯。吐温 。聚丙烯酰胺凝胶贮液（见附录 第 章）。（质量浓度）过硫酸铵：铝膜覆盖放置周后使用。（质量浓度）十二烷基磺酸钠。缓冲液（见附录 第 章）。缓冲液（见附录 第 章）。电泳缓冲液（见附录 第 章）。点样缓冲液（见附录 第 章）。转移缓冲液（见附录 第 章）。转移缓冲液（见附录 第 章）。封闭缓冲液（见附录 第 章）。（见附录 第 章）。（见附录 第 章）。分离胶（见附录 第 章）。浓缩胶（见附录 第 章）。检验程序金黄色葡萄球菌肠毒素检验程序见图。犛 犖犜 图金黄色葡萄球菌肠毒素 犃检验程序示意图检验步骤 样品制备和对照设置 检样 以无菌操作取液体检样 ，加入等体积点样缓冲液，加热 ，离心 。以无菌操作取固体检样进行均质，加入 生理盐水再均质。吸取 均质液，粘稠样品则可称取 ，加入等体积点样缓冲液成为样品制备液，加热 ，离心 。阳性对照将 标准物质用蒸馏水溶解制成 贮藏液。取贮藏液，用蒸馏水稀释至，使终浓度为 ，加入等体积点样缓冲液。加热 ，离心 。犛 犖犜 空白对照取 蒸馏水加入等体积点样缓冲液，加热 ，离心 。制胶 安装制胶配件。快速向配件内灌注分离胶溶液至三分之二处，立即用蒸馏水覆盖分离胶液面至配件顶端。静置大约 ，待凝胶凝固后与蒸馏水之间形成清晰的界线，吸干蒸馏水。向配件内凝固的分离胶上灌注浓缩胶溶液至配件顶端，插入 样梳。凝固后小心地移除样梳，用水冲洗齿孔并快速排干。注：一些厂商提供与其仪器相匹配的预制胶。电泳 组装电泳槽，向电泳槽内注入电泳缓冲液。分别取 样品制备液、阳性对照和空白对照，点样。每个样品之间以及与阳性对照之间尽量分开以减少交叉污染。在阳性对照邻近的齿孔加入 。选择合适的电压（）进行电泳，电泳时间为 或电泳至溴酚蓝到达分离胶底部。印迹 组装转移设备。将硝酸纤维膜置于转移缓冲液中预处理不少于 。将电泳凝胶和硝酸纤维膜组装于转移槽。组装应在转移缓冲液中操作，以免产生气泡。向冷却槽加入冰块，检查电极方向并连接电线。恒流转移，转移时间为。确认 转移成功后弃去凝胶。免疫反应 封闭将纤维膜置于 封闭缓冲液中轻轻摇动孵育 。第一抗体将抗 血清与封闭缓冲液按照 比例混合。将纤维膜置于 该混合液中轻轻摇动孵育。洗涤将纤维膜置于 封闭缓冲液轻轻摇动洗涤 。第二抗体将抗血清碱性磷酸酶与封闭缓冲液按照 比例混合。将纤维膜置于 该混合液中轻轻摇动孵育。洗涤和显色将纤维膜置于 封闭缓冲液轻轻摇动洗涤 ，重复洗涤次。加入 显色剂，显色时间为 左右，也可视具体情况而定。干燥纤维膜，扫描并保存图片。结果判断及表述 阳性对照出现预期条带，空白对照未出现条带，待测样品未出现相应大小的条带，则报告阴性结果。阳性对照出现预期条带，空白对照未出现条带，待测样品出现相应大小的条带，则需要按 对 的检验要求进行确认试验。确认试验结果是最终报告结果的依据。本试验检验灵敏度为 。犛 犖犜 附录犃（规范性附录）试 剂 配 制犃 聚丙烯酰胺凝胶贮液犃 成分丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺 蒸馏水 犃 制备将各成分溶解于蒸馏水，过滤后置棕色瓶中。可贮存 。犃 缓冲液将 溶解于 蒸馏水。加入 盐酸，加水定容至 。犃 缓冲液将 溶解于 蒸馏水。加入 盐酸，加水定容至 。犃 电泳缓冲液将 和 甘氨酸溶解于蒸馏水。搅拌至完全溶解。加入 十二烷基磺酸钠。犃 点样缓冲液将 、甘油和 巯基乙醇。加水定容至 。再加入 十二烷基磺酸钠和 溴酚蓝。犃 转移缓冲液将 和 甘氨酸溶解于蒸馏水。搅拌至完全溶解。犃 转移缓冲液将 转移缓冲液和 蒸馏水混合，再加入 甲醇。犃 封闭缓冲液将 氯化钠和蒸馏水混合。再加入 搅拌至完全溶解。加入 吐温 轻轻的搅拌，加水定容至。犃 犿 狅 犾犔犜 狉 犻 狊狆 犎将 溶解于 蒸馏水。用 盐酸调至 值至（约 ），加水定容至。犃 犿 狅 犾犔犜 狉 犻 狊狆 犎将 溶解于 蒸馏水。用 盐酸调至 值至（约 ），加水犛 犖犜 定容至。犃 分离胶犃 成分缓冲液 蒸馏水 （质量浓度）十二烷基磺酸钠 （质量浓度）过硫酸铵 聚丙烯酰胺凝胶贮液 犃 制备将各成分均匀混合，最后加入聚丙烯酰胺凝胶贮液。分离胶溶液中过硫酸铵和 的比例越低，凝固时间越长。其使用量可根据实际需要调整。犃 浓缩胶犃 成分缓冲液 蒸馏水 （质量浓度）十二烷基磺酸钠 （质量浓度）过硫酸铵 聚丙烯酰胺凝胶贮液 犃 制备将各成分均匀混合，最后加入聚丙烯酰胺凝胶贮液。犛 犖犜 书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准进出口食品中金黄色葡萄球菌肠毒素 犃检测方法电泳和免疫印迹法 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京复兴门外三里河北街 号邮政编码：网址 电话：中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号：定价 元