SNT 1664-2005 牛奶和奶粉中黄曲霉毒素M1、B1、B2、G1、G2含量的测定.pdf

SN/T1664-2005前言本标准修改采用IS014501:1998牛奶和奶粉一黄曲霉毒素M1含量的测定一通过免疫亲和色谱净化和高效液相色谱测定（英文版）。本标准根据IS014501:1998重新起草。为了方便比较，在资料性附录A中列出了本标准条款和国际标准条款的对照一览表。由于本标准对免疫亲和柱的性能进行了测试，将其适用范围进行了扩展等，本标准在采用国际标准时进行了相应的修改。这些技术性差异用垂直单线标识在它们所涉及的条款的页边空白处。在附录B中给出了技术性差异及其原因的一览表以供参考。为便于使用，本标准还做了下列编辑性修改：)“本国际标准”一词改为“本标准”；b)用小数点“.”代替作为小数点的逗号“，”；C)别除国际标准的前言、附录和参考文献。本标准的附录C、附录D为规范性附录，附录A、附录B、附录E为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国宁波出入境检验检疫局负责起草。本标准主要起草人：李佐卿、康继韬、孙大为、章再婷、谢东华、俞雪钧。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。SN/T1664-20052.3.1一次性注射器：10mL和50mL。2.3.2真空系统。2.3.3离心机：能产生6600r/min的转速。2.3.4移液管：1.0mL、2.0mL和50.0mL。2.3.5玻璃烧杯：250mL。2.3.6容量瓶：100mL。2.3.7水浴：能在302，502，35至37之间温度段使用。2.3.8滤纸。2.3.9有刻度的锥形玻璃试管：带玻璃磨口的瓶颈和瓶塞，容量为5mL、10mL、20mL。2.3.10高效液相色谱仪2.3.10.1无脉冲泵：可以调节到恒体积流量为1mL/min。2.3.10.2进样系统：具有固定进样量。2.3.10.3反相色谱柱：填充3m或者5m的十八烷基硅胶，加填充有反相材料的保护柱。2.3.10.4荧光检测器：激发波长365nm、发射波长435nm。2.3.10.5记录仪：带打印机或标绘器、或者电子积分仪、或者计算机数据处理系统。2.3.11分光光度计。2.3.12天平。2.4试样制备2.4.1牛奶将牛奶样品在水浴(2.3.7)中加热到3537。用滤纸(2.3.8)过滤，或者在6600r/min的条件下离心15min,至少收集50mL的牛奶试样，然后按照2.4.4继续进行分析。2.4.2奶粉称取10g样品（精确到0.1g)置于250mL的烧杯中。将50mL已预热到50的水每次少量地加入到奶粉中，用搅拌棒将其混合均匀。如果奶粉不能完全地溶解，将烧杯在50的水浴(2.3.7)中加热30min,仔细混匀。将牛奶乳浊液冷却至室温后，用少量的水将其全部转移到100L的容量瓶(2.3.6)中，再用水稀释至刻度。用滤纸(2.3.8)过滤，或者在6600r/min的条件下离心15min。至少收集50mL的牛奶试样，然后按照2.4.4继续进行分析。2.4.3免疫亲和柱的准备将一次性的50mL注射器筒(2.3.1)与亲和柱(2.2.1)的顶部相连，再将亲和柱与真空系统连接起来(2.3.2)。2.4.4样品的提取、纯化与衍生用移液管移取50mL的试样(2.4.1或2.4.2)到50mL的注射器筒(2.3.1)中，使它们以2mL/min3mL/min稳定的流速通过亲和柱，流速可以通过真空系统控制(2.3.2)。取走50mL的注射器简，并用干净的10mL注射器简代替。然后用10mL的水进行清洗，水的流速应该保持稳定。清洗后，继续抽空气至亲和柱的下部完全干燥。使亲和柱与真空系统脱离后，将4L乙腈(2.2.7)加入到10mL的注射器筒中将亲和柱上的黄曲霉毒素M1、B、B2、G1、G2洗脱下来。所有4mL乙腈通过亲和柱的时间至少需要60s,流速可以通过注射器的柱塞来控制。将洗脱液收集于锥形试管中(2.3.9)。将洗脱液同系列标准曲线工作液一样在氮气流(2.2.6)中挥发近干（如果蒸发至完全干燥，则会造成黄曲霉毒素M1、B、B2、G1、G的损失。)加入200L正已烷(2.2.2)和200L三氟乙酸(2.2.3)，在旋涡混匀器上混匀约5s10s,让混合物在40水浴(2.3.7)中放置10min,然后在氮气流(2.2.6)下再挥干，用0.5mL10%乙睛溶液(2.2.9)溶解，并在旋涡混匀器上充分混匀，供液相色谱用。2SN/T1664-2005注：如果注入HPIC的含有黄曲霉毒素M1的样品中乙腈含量超过10%，色谱峰变宽。如果水的含量超过90%，则对色谱峰的形状没有影响。2.5高效液相色谱测定2.5.1测定条件2.5.1.1泵以恒定流速将流动相(2.2.8)通过HPLC柱。根据需要（根据所用色谱柱的型号），调整HPLC流动相(2.2.8)中乙腈十异丙醇十水的比例，以保证使黄曲霉毒素M1、B、B2、G1、G2与其他成分的分离效果最佳。流动相(2.2.8)的流速根据所用色谱柱(2.3.10.3)的型号不同而有所差异。对于普通C1色谱柱（柱长约25cm、柱内径约4.6mm)而言，流速在1mL/min左右，效果最好；柱内径约3mm时，流速在0.5mL/min左右，效果最好。为了确定最佳的色谱条件，可以先将样品提取液（最好不含有黄曲霉毒素M1、B、B2、G1、G2)注入HPLC,然后再注人提取液与黄曲霉毒素M、B、B2、G1、G2标准溶液的混合液。2.5.1.2色谱性能标准曲线的线性度和色谱系统的稳定性需要经常检查，多次反复地对固定量的黄曲霉毒素M1、B、B2、G1、G2标准溶液进样，直至获得稳定的峰面积和峰高。相邻两次峰面积和峰高的差异不得超过5%。黄曲霉毒素M1、B、B、G1、G2的保留时间与温度有关，所以对测定系统的漂移需要补偿。过一段时间注人固定量的黄曲霉毒素M1、B、B2、G1、G2标准溶液，这些标准溶液的测定结果可以根据漂移的情况进行校正。2.5.2测定于HPLC注入适当体积的提取液(2.4,4)，应用的色谱条件与进样体积与测定标准曲线工作液时一样，这时洗脱液中含有的黄曲霉毒素M1、B、B2、G1、G2将会被分离出来。标准溶液和样品提取液的进样应该按照一定的顺序进行。当一系列样品提取液一个接一个地被进样时，建议每注入5个样品提取液后注入一个黄曲霉毒素M1、B、B2、G1、G%标准溶液。测定样品提取液衍生物的黄曲霉毒素M、B、B2、G1、G2的峰面积或峰高，从标准曲线上查出注入的样品提取液中所含有的黄曲霉毒素M、B、B2、G1、G2的质量数(ng)。如果样品提取液衍生物的黄曲霉毒素M1、B、B2、G1、G2的峰面积或峰高比最大浓度的标准溶液的大或高，用10%乙腈溶液将样品提取液衍生物定量稀释，重新注人HPLC分析仪中。黄曲霉毒素M1、B、B2、G1、G2衍生物的标准色谱图参见附录E。2.6结果计算与表述2.6.1牛奶2.6.1.1计算黄曲霉毒素M1、B、B2、G1、G2的含量按(1)式计算：Wm=mAX(V:/V)(1/W)(1)式中：Wm一黄曲霉毒素M、B、B2、G1、G2的含量，单位为微克每升(4g/L)。ma一根据样品洗脱液衍生物的黄曲霉毒素的峰面积或峰高，从标准曲线上查得的黄曲霉毒素的质量数，单位为纳克(ng)。V样品洗脱液衍生物的最终体积数，单位为微升(L)。V:一注入样品洗脱液衍生物的体积数，单位为微升（L)。V一通过亲和柱被测样品的体积数，单位为毫升(mL)。3