SNT 0477-1995 出口食品中B群链球菌检验方法.pdf

lSN中华人民共和国进出口商品检验行业标准s N/T 0 4 7 7 一 9 5出口食品中 B群链球菌检验方法Me t h o d f o r d e t e c t i o n o f g r o u p B s t r e p t o c o c c i i n f o o d s f o r e x p o r t1 9 9 5 一 0 9 一 0 6 发布1 9 9 6 一 0 1 一 0 1 实施中华人民共和国国家进出口商品检验局发 布中华人民共和国进出口 商品检验行业标准出口食品中B群链球菌检验方法s x/T 0 4 7 7 一9 5Me t h o d f o r d e t e c t i o n o f g r o u p B s t r e p t o c o c c i i n f o o d s f o r e x p o r t，主题内容与适用范围 本标准 规定了在绵羊 血琼脂平板上，用C A M P(C h r i s t i e,A t k i n s,M u n c h-P e t e r s e n 的 缩写)试验作为 对出口 食品中B 群链球菌检验方法。本标准 适用于出口肉 类、奶和奶制品中B群链球菌的检 验。其他食品可参照使用。2 设备和材料2.1 离心机5 0 0 0 r/m i n，离心 管5 0 m L,1 0 m L,2.2 蔡氏滤器。2.3 微孔滤膜，孔 径。.4 5 IS m,2.4 玻璃抽滤瓶。2.5 玻璃水循环真空泵。2.6 电 热恒温箱:温度2 0-6 0 0C。2.了 显微镜。2.8 定性滤纸。2.9 不锈钢厌氧菌培养罐。2.1 0 电冰箱。2.们乳钵、研棒或均质器。2.1 2 L形玻璃棒。2.1 3 金黄色葡萄球菌菌株A T C C-2 5 9 2 3,3 培养墓和试剂3.1 T o d d-He w i t t肉汤 参见附录A(补充件)A1),3.2 牛心汤培养基 参见附录A(补充件)A2),3.3 选择性牛心汤增菌培养基 参见附 录A(补充件)A 3),3.4 牛心汤琼脂 参见附录A(补充件)A 4),3.5 绵羊血琼脂平板 参见附录A(补充件)A5).3.6(-溶血素 参见附 录A(补充件)A 6),3.7 R-溶血素带 参见附 录A(补充件)A 7),3.8 绵羊血球 参见附录A(补充 件)A 8),3.9 生理盐水:灭菌的。.8 5%N a C l.3.1 0 革兰氏染色液 参见附录 A(补充件)A9),3.1 1 接触酶(过氧化氢酶)试验 参见附录B(补充件)。中华人民共和国国家进出口商品检验局1 9 9 5-0 9-0 6 批准1 9 9 6-0 1 一 0 1 实施S x/T 0 4 7 7 一9 54 样品的制备4.1 肉类4.1.1 冷冻产品应在 2-5 过夜解冻，或在 4 5 及以下经1 5 mi n解冻，立即检验。若不能及时检验.应置于一1 5 左右暂存。其他非冷冻易腐的食品，亦应置于4 冰箱保存。4.1.2 以无菌操作称取剪碎的肉类样品2 5 g,置于灭菌之乳钵内或 均质杯内，加入2 5 m L灭菌生理盐水进行研磨或均质(8 0 0 0 -1 0 0 0 0 r/m i n，均质 1 m i n)，移入盛 2 0 0 mL生理盐水的 5 0 0 0 mL广口瓶内，混合均匀，制成 1:1 0 稀释液。4.2 奶和奶制品类4.2.1 鲜奶、酸奶:以无菌手续去掉瓶罩纸盖，瓶口经火焰灭菌后，用无菌操作吸取 2 5 m L检样，放人装 有2 2 5 m L灭菌生理盐水的三角烧瓶内，振摇均匀。4.2.2 奶粉:以无菌手续开封取样，称取2 5 g 放人盛有2 2 5 m L温热的灭菌生理盐水且装有适量玻璃珠的灭菌广口瓶内，振摇使其充分溶解混匀。4.2.3 奶酪:先用灭菌刀削去部分表面封蜡，然后用点燃的酒精棉球灭菌表面后，用灭菌刀切开奶酪，再用无菌操作切取表层和深层检样 2 5 g，置于灭菌乳钵内切碎，加人 2 5 m L生理盐水研成糊状，移入盛有2 0 0 m L灭菌生理盐水的广口 瓶内，混合均匀。制成1 e 1 0 的稀释液。4.3 其他食品 样品的制备取决于食品的种类和状态。固体或半固体食品按 4.1.2 或 4.2.3 进行。液体食品按4.2.1 进行。检验步骤5.1 增菌培养 将上述制备的检样各取 1 0 mL分别接种于 1 0 0 m L牛心汤培养基内;如检样污染较严重，可同时按上 述量 接种 于选择性牛心 汤增菌液内，经3 5 士1 培养1 5 h，再进行C A M P 一 带或C A MP 一 点试验.5.2 C AMP试验的条件 将 C A MP试验的绵羊血琼脂平板置于不锈钢厌氧菌培养罐内，在 3 5 士1 培养。5.3 C AMP 一 带试验 取件溶血素带 1-2 条平行轻贴于绵羊血琼脂平板上，间距 2 0 mm，将样品或经过增菌的培养物直接在件溶血素带两侧(相距 3-5 mm处)垂直划线 3-4 条或涂布接种，经 1 4 1 8 h培养后观察结果。如在 接种线 与R-溶血素 带周围 朦胧溶血区 重叠处能见到协同产生清晰的“箭头”状的增强溶血区 为阳性反应，可鉴定为B群链球菌。不见增强溶血为阴性反应，判为B群链球菌阴性。5.4 C AMP 一 点试验 将样品 或经过增菌的 培养物直接划线或用L 形玻璃棒涂布接种于绵羊血琼脂平板上，经1 4 1 8 h培养后，用接种环取P-溶血素滴加在圆 形突起，细小的可疑为链球菌的单个菌落边缘，再将平板进行孵育，分别在3 0,4 5,6 0 m i n 检查溶血变化情况。在滴加件 溶血素的菌落边缘有协同产生“扇 形”增强溶血区的为阳性反应，可鉴定为B群链球菌。不出现增强溶血现象的为阴性反应，判为非B群链球菌。每次检验时都要用已知阳性菌株作为对照试验。5.5 C A M P-带或C A M P 一 点试验阳性反应，再进行革兰氏 染色.镜检和接触酶试验，以此来与其他溶血性细菌如李斯特氏菌，肉毒梭状芽胞杆菌和葡萄球菌等区别开。6 报告结果6.1 C AMP 一 带或C A MP 一 点试验阳性，细菌形态相符，革兰氏阳性，接触酶阴性，报告B群链球菌阳性。6.2 C A M P-带或C A MP 一 点试验阴性，报 告B 群链球菌阴 性。zS N/T 0 477 一 9 5 附录A培养墓和试剂 (补充件)A l T o d d-He w i t t 肉汤 牛肉 浸液1 0 0 0 m L 蛋白 陈2 0 g 1 0 mo l/L Na OH 2.7 mL Na HC 03 2 g Na C l 2 g N a,H P O,1 2 H 2 0 1 g 葡萄糖29 p H 7.8 将各成分溶解后，调 p H7.8。分装在 1 5 0 mL烧瓶中，每瓶 1 0 0 m L，在 1 1 5 下灭菌 2 0 m i n,A 2 牛心汤 培养 基 牛心 浸液(可以用牛肉膏5 g,蒸馏水1 0 0 0 m L 代替)1 0 0 0 m L 蛋白 陈2 0 g 葡萄糖39 Na HC 03 2 g Na C l 2 g N a 2 H P 0,1 2 H 2 0 2 g p H 7.4 将各成分溶解后，加入1 m o l/L 3 0 o N a O H，校正p H 7.4，分装 试管中，每管1 0 m L，于1 1 5 下高压灭菌 2 0 min,A 3 选择 性牛心汤增菌 培并墓 牛心汤培养基1 0 0 0 m L 三氮化钠。.0 7 5 g 结晶 紫0.0 0 2 g p H 7.4 除结晶紫外，将其他成分混合，加热溶解，校正p H7.4，再加人结晶紫，充分混合溶解后，分装于试管内，每管 1 0 mL，于 1 1 5 下高压灭菌 2 0 mi n,A 4 牛心汤琼脂 牛心浸液(可以 用牛肉 膏5 g,蒸馏水1 0 0 0 m L 代替)1 0 0 0 m L 蛋白 陈2 0 g 葡萄糖3 9 Na HC 03 2 g Na Cl 2 gs N/T 0 4 7 7 一9 5 N a,HP O;1 2 H,O 2 g 琼脂粉1 2 g p H 7.4 将各成分溶解后，加人1 m o t/1.3%N a O H，校正p H 7.4，加入琼脂粉1 2 g，于1 1 5 下高压灭菌2 0 mi naA5 绵羊血琼脂平板 将牛心汤琼脂加热溶化后.待冷却到 5 0 时，加经洗过的绵羊血球 5%，旋转混合均匀，倾注平板，冷凝备用。A 6 卜溶血素 将金黄色葡萄球菌 A T C C-2 5 9 2 3 菌株接种在T o d d-H e wit t 肉汤里，于 3 5 士1 生长4 8 h，培养液以3 5 0 0 r/m i n 离心1 0 m i n。取其上清液，用装有微孔滤膜的蔡氏 滤器作真空抽滤除菌，滤液则为件 溶血素。分装在灭菌带盖小瓶内，每瓶 5 mL.冰冻保存，备用。A 7 p 一 溶血紊带 把灭菌的定性滤纸条(约4 c m X 0.4 c m)浸泡在装有汗 溶血素的带塞玻 璃瓶中，则制成爵 溶血素带。置4 冰箱中 备用。A 8 编羊血球制备 将无菌新采绵羊血，用三倍灭菌生理盐水以2 5 0 0 r/m i n离心 1 5 min，弃去上清液，洗两次，最后用生理盐水将血球悬浮到原体积。A 9 革兰氏 染色液A 9.1 结晶紫染色液:结晶紫1 9 9 5%乙醇2 0 m L 1%草酸铁水溶液8 0 m L 将结晶紫溶解于乙醇中.然后与草酸按溶液混合.A 9.2 革兰氏 碘液:碘1 9 碘化钾2 9 蒸馏水3 0 0 mL 将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至 3 0 0 mL,A9.3 沙黄复染液:沙黄0.2 5 g 9 5%乙醇1 0 mL 蒸馏水9 0 mL 将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。A 9.4 染色法:A 9.4.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染 1 min，水洗。A 9.4.2 滴加革兰氏碘液，作用 1 m i n，水洗。A 9.4-3 滴加 9 5%乙醇脱色，约 3 0 s;或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色 aS N/T 0 4 7 7 一9 51 0 S,:水洗，滴加复染液，复染 1 m i n。水洗，待干，镜检。结果:革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。A9A9 附录B接触酶(过级化氮酶)试验 (补充件)B/试剂 3%过氧化氢溶 液:临用时配制。B 2 试验方法 挑取固体培养基上菌落一接种环，置于洁净试管内，或涂于干净的载玻片上，然后分别滴加 3%过氧化氢溶液 2 mL或一滴观察结果。B 3 结果 于 0.5 mi n内发生气泡(氧气)者则为接触酶阳性反应(葡萄球菌)，不发生气泡者则为阴性反应(链球菌)。附加说明:本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。本标准由中华人民共和国陕西进出口商品检验局负责起草。本标准主要起草人卢敬堂。